基于牙髓干细胞的神经系统疾病治疗新进展

程晨 彭杉 杨桐 综述 丁刚 审校

中枢神经系统和周围神经系统共同传输和处理感官信息，并控制和调节各系统器官的活动。创伤、脑缺血、神经退行性疾病等可以导致神经系统的炎症、轴突变性、神经元细胞结构畸形甚至死亡，严重影响患者身体健康和生活质量。由于神经前体细胞数量有限[1-3]，传统的治疗方法在神经元功能恢复方面疗效有限。干细胞是一类具有自我更新和高度分化潜能的细胞，能够分化为各种类型的功能细胞，基于干细胞的治疗策略为神经再生和修复提供了新的手段。其中，来源于神经嵴的牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)具有神经分化的潜能，在一定条件下，能被诱导成神经元或神经样细胞，并且能分泌多种神经营养因子，为治疗神经系统疾病和损伤提供了可能[4]。

1 DPSCs特性

1.1 DPSCs的培养

2000 年Gronthos等[5]首先从牙髓组织中分离并鉴定DPSCs，具有与骨髓间充质干细胞有相似免疫表型，能够自我更新和多向分化，具有较高的细胞增殖率和克隆形成能力。DPSCs一般分离自正常的阻生第三磨牙或者正畸减数牙，且多采用酶消化法进行原代培养[5-6]。

1.2 DPSCs的神经特性

DPSCs来源于颅神经嵴，可以在体外诱导为神经细胞，具有类似功能神经元的特征，比其他组织来源的间充质干细胞具有更强大的神经分化潜力[7-8]。Gonmane等[9]将DPSCs诱导为神经前体细胞，与包含耳蜗核的听觉脑干切片共培养，其神经元分化的特异性标记物原肌球蛋白受体激酶、GATA结合蛋白3及突触小泡蛋白高表达，并表现出细胞内钙震荡，这些实验结果表明自体DPSCs为感音神经性听力损失患者提供了新的治疗方法[9]。另有研究证明，DPSCs可以通过形成神经球而分化为多巴胺能神经细胞，为治疗帕金森病提供了可能[10]。与骨髓和脂肪间充质干细胞相比，DPSCs在体内外具有更高的增殖率，高表达并分泌神经营养因子，表现出更优异的神经保护和神经支持特性[11-12]。Geng等[13]研究者用白藜芦醇处理DPSCs，并与在神经元诱导培养基中培养的DPSCs比较，发现两组DPSCs的神经元特异性标记物(巢蛋白和神经丝蛋白)的mRNA表达和蛋白表达均上调，表明白藜芦醇具有与神经元诱导培养基相近的诱导DPSCs 神经元向分化作用。随着人们对DPSCs的深入研究，越来越多的临床前动物模型实验证明DPSCs在治疗神经系统疾病方面具有显著疗效，DPSCs可以在适当的条件下分化为神经元样细胞，并且分化的细胞表现出典型的电生理特性[14-15]。与之相反的是，胚胎干细胞和诱导多能干细胞修复神经损伤方面的证据尚不够充分[16]，且存在肿瘤形成、免疫排斥、伦理争议等问题[17], 因此DPSCs是一个促进神经修复和保护神经特性的良好细胞来源。

2 DPSCs治疗神经系统疾病的效果

多种体外、体内模型实验证明，DPSCs对神经系统疾病具有良好的治疗作用(表1)。

2.1 脑中风

Nito等[18]将DPSCs注入大鼠大脑中动脉阻塞模型，发现DPSCs显著抑制了小胶质细胞的活化和炎性细胞因子的表达，脑梗塞面积明显减少，运动功能障碍得到逆转，皮质缺血边界区域的神经元变性明显减轻。另有研究发现，丝裂原活化蛋白激酶和转化生长因子β信号通路参与了DPSCs介导的脑中风治疗，且DPSCs的治疗作用强于骨髓间充质干细胞[19]。Kota等[20]使用过表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的DPSCs治疗大脑中动脉阻塞的大鼠，发现过表达HGF增强了DPSCs缺血/再灌注后脑损伤的治疗作用，显著抑制小胶质细胞活化、炎性因子表达和神经元变性，减少脑梗塞面积，改善运动功能。再灌注后，过表达HGF的DPSCs能增加紧密连接蛋白，维持血脑屏障的完整性，并增加脑梗塞周围区域的微血管密度。Chiu等[21]将免疫分选的胰岛素样生长因子1受体阳性(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的DPSCs移植到缺血缺氧性脑病新生大鼠的脑中，发现DPSCs能够神经向分化，诱导神经突的再生，改善大鼠的神经行为，促进神经的可塑性和神经功能恢复。此外，有研究者将DPSCs衍生的神经球细胞移植入重度前脑缺血性损伤的大鼠脑内，发现DPSCs能提供神经保护作用，脑缺血显著改善，海马区神经元细胞死亡减少，提高了动物的运动功能、认识功能和总体生存率[22]。Nagpal等[23]主持了自体DPSCs治疗慢性中风患者的安全性和可行性的临床研究，不过最终结果尚未报道。

2.2 帕金森病

帕金森病(parkinson disease，PD)是一种常见的锥体外系变性疾病，主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的早期凋亡，临床表现为运动迟缓、步态障碍、僵硬和静息性震颤。因为其神经嵴来源、免疫调节作用、分泌神经营养因子、诱导轴突导向(axon guidance)、分化为功能性神经元等特性，DPSCs可成为PD治疗的细胞来源，为基于干细胞移植的PD治疗提供一种比较可靠的途径，在PD治疗中有潜在的应用价值[24]。Fujii等[25]将人脱落乳牙来源的DPSCs移植入6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine ,6-OHDA)诱导的大鼠PD模型中，发现DPSCs主要通过旁分泌机制促进PD大鼠神经功能的恢复，增加多巴胺水平，增强了内源性多巴胺能神经元的神经保护作用，促进了黑质纹状体的恢复。另有研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine , MPTP)诱导PD体外模型，与DPSCs在Transwell条件下共培养，发现DPSCs能减少该模型活性氧和一氧化氮产生，减轻DNA损伤，抑制促炎因子的表达，在PD体外模型的治疗中发挥神经保护和免疫调节的作用[26]。Chen等[27]将DPSCs条件培养基经尾静脉注入鱼藤酮诱导的大鼠PD模型，发现能够改善PD症状，增加纹状体酪氨酸羟化酶的表达，降低黑体和纹状体的α-突触核蛋白水平，进一步研究发现DPSCs条件培养基的治疗作用是通过调节胆碱能突触、钙信号通路和血清素能突触来实现的。

2.3 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)是常见的神经退行性疾病之一，临床表现主要为痴呆和智力下降，主要病理变化为β-淀粉样肽沉积和Tau蛋白磷酸化[28]。Wang等[29]用大田软海绵酸作用于人成神经细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)来制备AD细胞模型，然后将DPSCs与AD细胞模型进行Transwell共培养，发现AD体外模型的细胞活力升高、凋亡减少，收缩的树突重现再拉长，微丝紧密排列，微管纤维增厚，Tau蛋白的Ser 396磷酸化显著受到抑制。另有研究显示DPSCs分泌血管内皮生长因子、单核细胞趋化蛋白1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子，显著降低β-淀粉样肽的细胞毒性，刺激凋亡抑制因子Bcl-2的生成，并降低凋亡促进因子Bax，从而使细胞凋亡减少，说明DPSCs有望成为治疗AD的候选药物[30]。Zhang等[31]将淀粉样蛋白-β1-42注入大鼠海马回制备AD模型，然后把DPSCs注射入海马回，发现神经元相关的双皮质素、特异性核抗原蛋白和神经丝蛋白200表达升高，β-淀粉样肽水平降低，且动物的认知能力和行为能力显著地改善，作者认为DPSCs通过调节神经元相关蛋白的分泌改善了AD的症状。

2.4 肌萎缩性侧索硬化症

肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是上下运动神经元进行性丢失为特征的一种神经系统变性病，涉及中枢神经胶质与周围免疫反应和神经肌肉接头之间复杂的相互作用关系。研究者将DPSCs条件培养基注射到mSOD1G93AALS小鼠动物模型的腹腔内，结果显示，无论在疾病的哪个阶段注射DPSCs条件培养基，都能明显促进神经肌肉接头部位的神经支配，防止运动神经元丢失并延长了动物的寿命，而灰质前角部位的反应性神经胶质分裂并不受影响。关于DPSCs治疗ALS的机制，作者考虑与DPSCs分泌的各种因子对运动神经元胞体和神经肌肉接头部位的神经营养作用有关[32]。

2.5 脊髓损伤

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤中最严重的并发症，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常等的相应改变。脊髓损伤不仅给患者本人带来身心的严重伤害，而且对社会造成严重的经济负担。一项体内研究试验表明，将DPSCs注入完全横断的大鼠脊髓模型，发现DPSCs能减少炎症性损伤，促进轴突再生，并减少SCI后的进行性出血性坏死，且有部分DPSCs在体内存活并分化为成熟神经元和少突胶质细胞，从而促进了SCI鼠的运动功能恢复。至于相关机制，作者认为与DPSCs抑制白细胞介素-1β、Ras Homolog基因家庭成员A和磺酰脲受体1的表达相关[33]。另有研究表明，将预先血管化的DPSCs植入大鼠受损的脊髓中，可以促进血运重建及轴突再生，恢复髓磷脂蛋白的沉积和感觉功能，具有血管生成和神经营养潜力，对SCI具有明显的改善和调节作用，DPSCs的促血管形成和神经营养特性发挥了主要作用[34]。Zhang等[35]将DPSCs与壳聚糖支架复合，然后移植到SCI大鼠，发现显著促进了脑源性神经营养因子、神经胶质细胞源性的神经营养因子和神经营养因子-3的分泌，抑制细胞凋亡，促进了大鼠的后肢运动功能恢复，Wnt/β-catenin信号通路介导了DPSCs的治疗作用。

2.6 周围神经损伤

DPSCs可作为种子细胞构建组织工程的人工神经。在一项研究中，将兔的DPSCs注入兔面神经损伤处，明显改善了面神经功能的恢复，兔再生神经纤维数量增多，纤维直径和髓鞘厚度增加，其修复机制可能与神经营养因子表达上调有关[36]。研究者制备大鼠面神经挤压伤模型，并局部注射DPSCs，14 d后大鼠的耳语动作恢复，组织学检查显示，轴突变性和无髓鞘轴突减少，神经纤维脱髓鞘减少，髓鞘排列规则，研究者认为神经生长因子发挥了重要作用[37]。研究者将DPSCs输入大鼠坐骨神经缺损模型，发现DPSCs可以迁移到神经缺损处，并表达施万细胞的标记物 S1 00b，移植后1 个月可见显著的轴突再生[38]。

研究者用链脲霉素诱导糖尿病大鼠模型，48 周后，将DPSCs注射到动物后肢的骨骼肌处(共10个注射点)。注射4 周后，局部的运动/感觉神经传导速度明显加快，电流感觉阈值降低，骨骼肌毛细血管密度增加，表皮内神经纤维密度增加，髓磷脂厚度增加，背根神经节神经元的神经突外伸生长明显，施万细胞的髓磷脂相关蛋白表达升高，DPSCs通过分泌神经营养因子改善了糖尿病引起的神经病理学改变[39]。

3 总 结

综上所述，DSPCs作为组织工程的种子细胞来源具有较多优势，在神经系统疾病的修复和再生方面有良好的应用前景，但是将DPSCs 用于神经系统疾病的临床治疗仍面临很大的挑战：(1)目前仍然没有得到一致认可的DPSCs体外神经诱导分化方案；(2)目前绝大多数研究主要是利用体外模型和啮齿类动物模型，在大动物模型的研究较少；(3)DSPCs能分泌多种生物活性因子，这些生物活性因子相互作用且作用复杂，它们在DSPCs介导的神经修复与再生方面发挥的作用尚不明确；(4) DSPCs治疗神经系统疾病的相关作用机制的研究较少，且机制不明确。只有这些问题有了满意的答案，才能够进行下一步临床研究，DSPCs才能安全、有效地治疗神经系统疾病。