肿瘤转移的“拦路虎”——失巢凋亡的作用机制和调控因子

汪芮萱，杨林，魏立彬

(中国药科大学，江苏 南京 210009)

1 介绍

肿瘤的转移是导致癌症死亡率升高的主要原因[1,2]，因此深入研究转移的机制对于开发更有效的肿瘤治疗剂至关重要。转移的完成与一系列复杂的动态过程密切相关：局部浸润，从原发部位解离，血管浸润，进入循环系统以及在远处靶器官增殖形成转移灶。这整个过程的顺利完成离不开肿瘤细胞内各种复杂的信号转导通路的参与，通过产生遗传学和/或表观遗传学的改变，从而实现进一步的存活和增殖[3]。转移的发生与患者预后不良，晚期复发以及死亡率升高都密切相关[4]，因此，对于转移更细致深入的了解，有助于未来探索与改进相关的治疗方法。当细胞从细胞外基质(ECM)脱离时，由于营养缺乏、机械损伤、免疫反应等原因往往会触发一种特殊的凋亡反应，这种凋亡被称为“失巢凋亡”。本文对于肿瘤转移过程中失巢凋亡的分子机制以及失巢凋亡抗性的产生的机制和相关靶点进行综述。

2 失巢凋亡的分子机制

失巢凋亡作为细胞凋亡的一种，是由内源性(线粒体)途径和外源性(死亡受体)途径共同调节的[5]。

内源性途径：当细胞脱离ECM后，由于DNA损伤或者缺氧等反应的发生形成凋亡信号，启动内源途径，以维持细胞的完整性和体内内环境的稳态[6,7]。首先，凋亡蛋白Bax和Bak易位到线粒体外膜(Outer mitochondrial membrane，OMM)并在OMM形成寡聚物，使得线粒体的膜电位下降，通透性增强形成一个孔道[8]，线粒体蛋白(如细胞色素C)可以通过该孔道释放到线粒体外[9-12]。细胞色素C的释放能够触发凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)介导的caspase-9和caspase-3激活，从而启动下游蛋白的水解级联反应，引起细胞凋亡[13]。

外源性途径：外源性途径主要通过细胞外死亡配体(例如FASL或TRAIL)调节，当它们结合到细胞表面的受体(例如Fas，TNFR1)上时，引起受体的寡聚化，使得该途径激活[14]。Fas相关死亡结构域蛋白(Fas associated protein with death domain，FADD)不具有酶的活性，但有两个结构域，即羧基端的死亡结构域和氨基端的死亡效应结构域(Death effected domain，DED)。FADD的DD可以与Fas分子胞浆段内的DD相结合，其DED则可以连接pro-caspase-8的DED部分，形成死亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex，DISC)[15]。DISC能够促进pro-caspase-8进行活性加工，使得活化的caspase-8释放到细胞质中激活下游caspase-3和caspase-7，启动下游蛋白水解级联反应，引起细胞凋亡[14,16]。

3 失巢凋亡抗性的调控机制

3.1 EMT与失巢凋亡抗性

EMT最先由Greenberg和Hay在1982年发现的一种生物过程，在该过程中，上皮极化细胞会经历各种生化修饰，最终转化为非极化细胞。许多证据表明，EMT不仅是上皮细胞获得活动性和侵袭性表型中的关键事件，而且还是失巢凋亡抗性获得的重要过程之一[17]。

3.1.1 表面标志物的改变

近年来的研究发现，EMT的发生主要体现在各种细胞表面标志物的改变，其中上皮细胞标志物主要有：E-钙黏蛋白(E-cadherin)，β连环素(β-catenin)和紧密连接蛋白(occludin)等，间质细胞标志物主要有：N-钙粘蛋白(Ncadherin)，中间丝波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等。E-cadherin作为最经典的上皮细胞标志物，在各型EMT中表达均下降[18]。与E-cadherin相反，N-cadherin在EMT中被上调，这种钙黏蛋白由E-cadherin向N-cadherin的转变被称为“钙黏蛋白开关”，往往被用于监测EMT的 进程[19]。

3.1.2 整联蛋白介导的细胞粘附

整联蛋白是一种膜镶嵌蛋白，是由α和β亚基组成的非共价二聚体。它的胞外结构域能够识别纤连蛋白和层粘连蛋白，通过与之结合引起构象改变，激活粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)等信号分子，启动下游的信号传导。胞内结构域能够结合肌动蛋白，从而实现细胞内外信息的双向联络。整联蛋白介导的细胞的粘附对于EMT的发生起着决定性的作用，对于失巢凋亡抗性的产生也至关重要。研究发现，敲除ITGB4或者ITGA6之后，会引起失巢凋亡现象的增多[20,21]。除了整联蛋白之外，FAK的激活或者过表达对于失巢凋亡抗性的产生也起着至关重要的作用[22]。

3.2 自噬与失巢凋亡抗性

自噬是一种溶酶体介导的细胞自我消化的途径，其作用是为了实现真核细胞中受损、老化、功能异常的细胞器或其他多余细胞质分子的再循环，并且产生营养和能量以维持内环境的稳态，提高细胞的存活率[23]。它通过形成一个双膜囊泡，即自噬小体，吞噬细胞质成分，并将其传递到溶酶体中进行降解。在酵母细胞中，自噬受30多种自噬相关基因(ATG)调控[23]。在之前的研究中发现，Beclin1(ATG6)的缺失会导致小鼠肿瘤发生的增加，ATG5或ATG7的缺失会导致氧化应激的积累，促进肿瘤的发展[24,25]，这些说明自噬的存在对于肿瘤发展有抑制作用。然而，在已建立的肿瘤中，癌细胞需要利用自噬克服环境的压力(例如：营养缺乏、缺氧和药物损伤等)，这说明自噬在一定情况下却具有促进肿瘤生长的功能。由于这种双重功能，自噬也被称为癌症进展中的“双刃剑”[26]。

3.2.1 自噬与EMT

自噬只是最近才与EMT连接。近年来，一些研究表明，自噬和整联蛋白信号转导之间存在一定的关系[27]。细胞ECM附着位点的整联蛋白受体为粘着斑(focal adhesion，FA)的形成提供了结构基础，通过张力改变引起粘着斑蛋白磷酸化状态改变，并改变蛋白构象，促进粘着斑的稳定和生长[28-30]。整合素-ECM粘附的丧失在癌性和非癌性上皮细胞中均诱导自噬，这有利于失巢凋亡抗性产生，使得肿瘤细胞的转移能力增强[31,32]。

综上所述，自噬可能通过影响细胞表型的改变或者影响粘着斑的稳定和降解等方面来影响EMT从而导致失巢凋亡抗性的产生。

3.2.2 自噬与氧化应激

在对于乳腺肿瘤模型的研究中发现，自噬与蛋白激酶R样内质网激酶(PERK) 的活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)依赖性活化相关[31]。目前已经证实，PERK可以促进多种癌细胞(包括导管癌乳腺癌细胞、结直肠腺癌细胞和高度转移性的人纤维肉瘤细胞)产生失巢凋亡症抗性[33]。在ER中错误折叠的蛋白积累之后，未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)的激酶PERK变得活跃，激活eIF2α[34,35]，使得转录因子ATF4的上调，从而促进许多细胞存活途径存活[36]。最近一项研究发现，ATF4缺陷的人纤维肉瘤细胞容易发生失巢凋亡，而当恢复ATF4的表达时，失巢凋亡的发生会被阻断，细胞更容易存活[33]。

3.3 代谢改变与失巢凋亡抗性

细胞从ECM分离会引发一系列代谢改变，例如葡萄糖摄取不足、细胞ATP含量降低以及线粒体产生的ROS升高等[37]。为了抵抗这些压力，快速分裂的肿瘤细胞需要快速的ATP生成，并维持适当的氧化还原状态以支持细胞分裂。肿瘤微环境中氧气水平和营养水平较低[38]，不利于肿瘤细胞生长，因此，肿瘤细胞通过代谢重编程，以满足肿瘤生长的需求。Warburg效应是肿瘤细胞中最典型的代谢表型，即相比于正常的细胞，肿瘤细胞会消耗更多的葡萄糖，而且，肿瘤细胞的糖酵解速率远高于氧化磷酸化速率[39]，这为肿瘤细胞的生长和增殖提供了重要的能量和物质基础。

ROS是线粒体有氧代谢的固有的产物，正常情况下，ROS能够维持在一个稳定的水平，当平衡被打破的时候，它则有可能促使细胞发生转变，从而促进肿瘤的发生发展。在脱离基质后，由于ROS的升高，会激活NF-κB，使得超氧化物歧化酶(Managanese superoxide dismutase，MnSOD)的表达上调，MnSOD是一种ROS清除剂，能够减少ROS的损伤，与原发性肿瘤相比，MnSOD在转移灶的表达水平更高。因此，ROS的清除有助于癌细胞产生失巢凋亡抗性[40]。ROS也可以通过激活SRC诱导生存信号产生，活化的SRC可以通过不依赖配体的方式磷酸化EGFR，从而激活MAPK/ERK和PI3K/Akt途径，最终导致Bim降解和失巢凋亡抑制，这一说法在肠道上皮细胞和转移性前列腺癌细胞中均得到了证实[41,42]。

3.4 生长因子与失巢凋亡抗性

循环系统中的细胞因子和生长因子等有助于转移的调节[43]。由于生长因子受体能够激活细胞存活途径抑制细胞死亡途径，因此生长因子受体或其信号传导途径的表达失控与肿瘤的恶性程度相关。生长因子受体的异常调节能够激活生存信号通路，抑制失巢凋亡从而导致转移。转化生长因 子-α(Transforming growth factor-α，TGF-α)是EGFR的配体，它能够逆转由于附着丧失引起的Src活性和Bcl-xL表达下降来防止肠道上皮细胞的失巢凋亡[44]；转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)通常与转移潜能增加以及患者预后差相关，其主要通过TGF-β1/ Smad信号传导在EMT过程中起着至关重要的作用[45]。此外，TGF-β1也可以直接激活MAPK途径，促进细胞的侵袭和转移；胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factors-1，IGF-1)被称为一种“促生长因子”，它对于脱离基质的细胞的保护作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的[46,47]；血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)也与肿瘤转移有关，在脱离了ECM的人肺腺癌细胞中，PDGF的受体能够激活Src，并激活下游的生存信号通路[5]。

4 总结

正常的上皮细胞存活和增殖依赖于与ECM的粘附，当这种粘附被破坏时，容易引发失巢凋亡。失巢凋亡受到不同信号通路的调节，主要通过内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径激活。EMT的发生对于失巢凋亡抗性产生有着一定的促进作用，自噬对于失巢凋亡的影响是个动态变化的过程，其可以通过影响EMT、氧化应激反应和免疫应答的发生影响失巢凋亡。细胞在脱离基质的粘附之后也会引发一系列的代谢变化，而肿瘤细胞可以通过Warburg效应恢复PPP过程，也可以通过MnSOD的表达减少ROS的损伤或者启动一系列生存信号途径以维持细胞的存活。大多数癌症的死亡是由于转移的发生而不是原发性肿瘤，而失巢凋亡逃逸是转移发生的必经之路，因此对于失巢凋亡抗性的机制研究有助于为癌症的治疗方法提供新的思路。