miR-365抑制TGF-β诱导的人肺癌细胞上皮-间质转化

王玉娜,苟德明，侯玲,康康，刘红梅

1.宁夏医科大学基础医学院，宁夏银川750004；2.深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳518060；3.深圳大学医学部基础医学系，广东深圳518060

肺癌被认为是一种老年性癌症，据统计，中国男性癌症患者中肺癌患者约占21%，随着年龄的增长，其发病率和死亡率都不断增高，老年患者比例超过了三分之二[1,2]。上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT) 是指在某些特定的生理或病理情况下上皮型细胞向间质型细胞表型转变的过程[3]。已有的研究表明，TGF-β、Notch、NF-ΚB 等信号通路均可诱导EMT 发生。microRNA 的异常表达在肿瘤的发生发展如增殖、凋亡过程中起着重要作用[4]。研究发现miR-491 通过下调 B-crystallin 的表达从而抑制胶质母细胞瘤细胞的EMT 过程[5]。另有研究发现在人肺癌细胞系中，miR-23a 与EMT 密切相关[6]。已有报道证明miR-365 在肿瘤发展过程中异常表达[7]，如它通过靶向下调E2F2 基因从而抑制胃癌细胞的增殖[8]。但miR-365 在EMT 发生发展过程中的变化及作用报道很少，本研究初步探讨了miR-365 在TGF-诱导的人肺癌A549 细胞EMT过程中的变化和作用。这对早期预防和治疗由EMT 引发的肺癌提供了新的思路和方向，同时也为降低老年人患肺癌的概率找到了新突破口。

1 材料与方法

1.1 试剂 重组人TGF-β购自Sigma-Aldrich 公司；PEI 转染试剂购自Polysciences,inc.America；构建miR-365 过表达载体时的PCR 引物由生工生物（上海）股份有限公司合成；E-cadherin 及-actin 兔多克隆抗体均购自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 细胞培养 人肺癌细胞A549 购自美国模式培养物集存库(ATCC)。使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养，培养箱条件为37°C、5%CO2。

1.3 慢病毒包装及细胞分组处理 构建miR-365 的过表达载体质粒(过表达miR-365 命名为pLVX-miR-365，未过表达miRNA的命名为pLVX-control作为对照。)。用PEI转染试剂共转染过表达质粒和病毒包装质粒于293T 细胞中，48 小时后收取上清液离心冻存备用。

检测TGF-β刺激A549 细胞产生EMT及miR-365的表达实验。细胞分为2 组：（1）TGF-β组，加入5 ng/mL TGF-β刺激A549 细胞48 h；（2）对照组，未加入任何试剂，培养A549 细胞48 h。

检测miR-365 在EMT 发生中的作用实验。细胞分为4 组：（1）添加miR-365 慢病毒于A549 细胞中；（2）添加对照组慢病毒于A549 细胞中；（3）添加miR-200c 慢病毒（大量文献表明miR-200c 抑制EMT发生，本文引用miR-200c 作为阳性对照）于A549 细胞中；（4）不添加任何慢病毒的A549 细胞。感染完成后，对miRNA 的过表达进行检测，并对四组细胞进行5 ng/mL TGF-β刺激。

1.4 荧光定量PCR 检测A549 细胞中miR-365 的表达分别提取用TGF-β刺激和未经TGF-β刺激的A549 细胞总RNA，对于miRNA 的检测，采用已经申请专利的荧光定量PCR 法即S-Poly (T) 法。S-Poly (T) 法检测miRNA 时需要先给RNA 加尾，即加polyA，反应体系：总RNA 1g、A-Plus Buffer 1L、10 mM ATP 1L、Poly (A) Polymerase (4 U/L) 0.25L，补充无RNA 酶的水至反应体系至10L。加尾后的RNA 进行逆转录，使其变成cDNA，逆转录反应体系：加尾RNA100 ng、RT-primer 1L、5×M-MLV Buffer 2L、RTase M-MLV（RNase H）（200 U/L）0.5L、2 mM dNTP mix 2.5L，补充无RNA 酶的水至反应体系至10L。miR-365 的Real time PCR使用Taqman 探针法，反应体系：5×Colorless GoTaq Reaction Buffer 4L、2 mM dNTP mix 2L、GoTaqDNA Polymerase 0.5 U、10M 3UnivRP 0.4L、10M Probe 0.5L、ROX Reference Dye (50×) 0.4L、cDNA 2L、miRNA primer (1M) 4L，补充反应体系至20L。以snord47 为内参在ABI Stepone Plus Realtime PCR 仪运行程序，miR-365 的表达变化使用2(-CT)计算方法进行计算。实验重复3 次。

同理使用该方法检测感染慢病毒之后的A549 细胞中miR-365 和miR-200c是否过表达，以U6 为内参。

1.5 Western blot 方法检测E-cadherin 蛋白的表达变化感染慢病毒（miR-365 组、miR-200c 组、对照组）和未感染慢病毒（blank）的A549 细胞在未经TGF-刺激和经过TGF-β刺激48 小时后，弃去上清液，使用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白，BSA 检测蛋白浓度。按照蛋白浓度取蛋白，加入适量的6×蛋白质加样缓冲液于沸水浴中孵育5 分钟，上样，SDS-PAGE电泳，转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 小时，加入一抗（anti-E-cadherin 1:1000）4℃过夜,TBST 洗膜3 次，每次5 分钟，加入二抗1∶10000 室温下孵育1 个小时，TBST 洗膜4 次，每次5 分钟。使用ECL 显色。

1.6 统计学分析 所有实验均重复3-4 次。对于Western blotting 实验，仅展示了具有代表性的图片。数值的表示方式为均数±标准差（±s）。使用GraphPad Prism version 5.0 software 数据分析系统的双侧t 检验进行统计学分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β诱导A549 细胞从多角形变为长纤维形 培养人肺癌细胞至对数生长期，加入TGF-β刺激细胞48小时，显微镜下观察A549 细胞形态，随机选取3 个视野拍照。从图1可以看出，与对照组（未经TGF-刺激的A549 细胞）相比，TGF-β刺激后的A549 细

图1 5ng/ml TGF-β处理A549 细胞48 小时后的细胞形态

2.2 TGF-β上调A549 细胞中miR-365 的表达 培养A549 细胞至对数生长期，加入TGF-β刺激细胞48 小时后，分别提取对照组和TGF-β刺激组细胞的RNA，荧光定量PCR 检测结果显示：与对照组相比，TGF-刺激组miR-365 的表达明显升高（图2）。说明TGF-上调了A549 细胞中miR-365 的表达。

图2 TGF-β上调A549 细胞中miR-365 的表达

2.3 过表达miR-365 抑制TGF-β诱导A549 细胞的上皮-间质转化 感染miR-365、miR-200c 和对照慢病毒于A549 细胞中，荧光定量PCR 检测miR-365 和miR-200c 均有明显的过表达，如图3所示，说明过表达miRNA 的稳转A549 细胞筛选成功。TGF-β刺激稳转A549 细胞，Western blot 检测Ecadherin 蛋白（EMT 相关蛋白）的表达变化，如图4所示，TGF-刺激后，细胞发生EMT，Ecadherin 的表达明显降低，过表达miR-365 和空白对照及对照组相比，Ecadherin 的表达升高（与阳性对照miR-200c 作用一致），即miR-365 抑制了细胞上皮间质转化。

图3 miR-365 和miR-200c 在A549 细胞中过表达

3 讨论

图4 miR-365 对EMT 相关蛋白Ecadherin 表达的影响

上皮间质转化（EMT）与多种慢性疾病的发生及肿瘤的转移都有密切关系。大量实验证明，细胞发生EMT，其迁移能力和抗凋亡能力均增强[9]。近年来，EMT 机制也被认为是上皮来源的恶性肿瘤细胞发生迁移和侵袭的新研究方向[10]，所以研究EMT 的发生机制对于肿瘤的预防和治疗有重要的意义。转化生长因子- （TGF-β）信号通路被广泛认为是调控EMT过程的信号通路。TGF-β信号介导的EMT 可以通过Smad 通路完成，TGF-β与肿瘤细胞膜上的受体T RI和T RII 结合，激活Smad2 和Smad3，并与Smad4结合进入细胞核,与其他转录因子一起介导靶基因的表达，最终使得细胞内的E-cadherin 蛋白低表达[11]，与此同时，Smad 复合物也能诱导miRNA 的表达，本研究初用TGF-β刺激细胞后，发现miR-365 的表达明显升高，说明该过程的发生有可能是Smad 复合物诱导了miR-365 的表达，本次实验中还发现TGF-β刺激的细胞形态也发生了明显变化，带着疑问我们对EMT相关蛋白E-cadherin 的表达进行了检测。E-cadherin蛋白主要分布在上皮细胞，贯穿细胞之间的连接，维持着上皮细胞的完整，E-cadherin 异常表达与EMT有直接联系[12]。

EMT过程是上皮细胞向间质细胞转移的过程，上皮的可塑性必须由级联式的转移做调控，而miRNA被认为是这个级联转移反应的关键调控因素[13]。大量研究证明miRNA 直接调控E-cadherin 的表达，如在乳腺癌细胞中，miR-9 直接靶向E-cadherin 基因[14]，miR-200c在口腔鳞状细胞癌中通过抑制EMT的发生从而抑制了肿瘤转移[15]。miR-200c 是参与EMT 过程最经典的miRNA，已被大量文章报道，所以本实验将miR-200c 作为阳性对照，从结果可以看出，miR-200c 确实逆转了EMT 过程，并且效果明显。参与发生EMT 的信号通路已有大量报道，如经典的TGF-β信号通路，Wnt/ -catenin 信号通路，Notch 信号通路等，但是miRNA 通过与信号通路相互作用参与EMT 过程的报道较少并且不全面，目前相对报道较多的有P53 信号通路，研究发现P53 通过上调miR-34 的表达从而维持细胞的上皮表型[16]，同样本实验中TGF-β通过上调miR-365 抑制EMT 发生，通过稳定E-cadherin 的表达维持细胞上皮表型。

目前肺癌的治疗除了常规的化疗还有免疫治疗，对于癌症患者化疗虽起到杀死癌细胞的作用，但是副作用也显而易见，尤其是老年患者，近几年免疫治疗的效果高于化学疗法，并且其对年轻患者和老年患者的效果无明显差异[17]，所以免疫疗法成为治疗老年肺癌的首选之一。本研究证明TGF-β上调了肺癌细胞中miR-365 的表达，过表达miR-365 稳定了E-cadherin的表达从而抑制TGF-β诱导的EMT 发生。EMT 被逆转，癌症的发生几率也会明显降低，所以本研究为肺癌的发生提供了新的研究方向，miR-365 可作为由EMT 引发的肺癌早期预防和治疗的一个新指标，同时也将成为老年病的新型诊疗方法。