早发性卵巢功能不全患者中SIRT1与氧化应激的相关性研究

郭路，刘晓程，马淼，杨航，陈秀英，李斌，顾超

1.复旦大学附属妇产科医院妇科，上海200011；2.上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海200090；3.复旦大学上海医学院，上海200032

随着人们对生活质量的追求越来越高，卵巢功能的保护以及其衰老的延缓越来越受到女性们的关注。近年来，早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI) 也称为卵巢早衰，发病率逐年升高，严重危害女性健康。POI 病因复杂多样，发生机制尚不明确。氧化应激相关基因在卵巢衰老过程中发挥着重要作用，可能参与始基卵泡生成、卵泡生长、成熟及闭锁等过程，进而参与POI 致病进程。组蛋白去乙酰化酶（Sirtuin1，SIRT1）是1 种去乙酰化酶，参与应激防御和抗衰老相关酶的表达，在氧化应激中的作用已得到共识[1]。本研究拟检测POI 患者血清氧化应激及SIRT1 水平变化，探索POI 患者血清氧化应激水平与SIRT1 的关系，并进一步在细胞水平检测氧化应激对人卵巢颗粒细胞功能的影响，为干预POI提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年6月—2020年6月在复旦大学附属妇产科医院门诊就诊的患者90 例，根据血清促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平分为正常对照组（A 组，FSH<10U/L，n=30）和POI 组，POI 组再分为2 个亚组：B 亚组（25U/L40U/L，n=30）。本课题资料收集已获得我院伦理委员会同意并批准（审批号：2019-106）。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：患者年龄<40 岁；无化疗、放疗、自身免疫性疾病、卵巢原发或转移肿瘤、盆腔及卵巢炎症性疾病、盆腔或卵巢手术史；无生殖相关家族病史；至少3 个月内未使用过激素类药物；正常对照组患者，平素月经规律，经量正常，未绝经，血FSH<10U/L；POI 患者组患者月经稀发或闭经，血FSH>25U/L；自愿参与本课题研究并签署知情同意书。排除标准：患者年龄≥40 岁；有化疗、放疗、自身免疫性疾病、卵巢原发或转移肿瘤、盆腔及卵巢炎症性疾病、盆腔或卵巢手术史；生殖相关家族病史；3 个月内使用过激素类药物。

1.3 检测指标与方法 晨起采外周全血后30 min 内离心，取上层血清，置于-80℃冻存，并收集临床基本资料[2]。（1）超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SIRT1活性及SIRT1 含量检测：全血收集后4℃离心10 min，取上清，酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测相应指标的水平。（2）人卵巢颗粒细胞瘤细胞KGN 凋亡检测：前1 d 将KGN 细胞用6 孔板铺板（5×105/孔），取不同浓度的H2O2（0、50、100、200mol/L）干预24 h，筛选最佳浓度，建立氧化应激损伤KGN 模型[3]。胰酶消化，4℃离心5 min，1000 g，加入5L 的Annexin V-PE 及5l 7-AAD，避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。（3）活性氧（reactive oxygen species，ROS）活性检测：每孔加入20mol/L 的DCFH-DA 工作液1 mL，37 ℃细胞培养箱内避光60 min，流式细胞仪检测ROS 活性；（4）线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）检测：加入罗丹明123染液10g/mL，37 ℃细胞培养箱孵育30 min，流式细胞仪检测MMP 水平。（5）E2和AMH 检测：收集正常对照组与氧化应激损伤KGN模型组细胞上清液，4℃离心10min，取上清，ELISA 检测E2和AMH 浓度。

1.4 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测 检测细胞中SIRT1、抗缪勒管激素2 型受体（anti-mullerian hormone type 2 receptor，AMHR2）、促卵泡激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）、黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor ，LHR）表达水平：采用100mol/L 的H2O2干预KGN24h 后，制备蛋白样品，BCA 测定蛋白浓度，25g 蛋白样品上样，60 V 浓缩胶，120 V 分离胶电泳，330 mA 恒电流转膜90min，牛奶封闭60min。一抗稀释液（SIRT1，1∶2000；FSHR，1∶2000；AMHR2，1∶2000；LHR，1∶2000）4℃孵育过夜。摇床室温孵育二抗1 h，发光仪曝光。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0 软件进行数据分析。连续性计量资料采用均数±标准差（±s）表示，数据符合正态分布，方差齐，用单因素方差分析，并进一步通过LSD 进行组间比较，若方差不齐，用非参数检验。符合正态分布的数据运用Pearson 相关分析，不符合正态分布的数据行Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组基线资料比较A 组患者年龄为17～39 岁，平均年龄为（29.1±6.5）岁，平均体质量指数(BMI) 为（22.08±3.17）kg/m2，其中2 例患者有吸烟史；B 亚组患者年龄为18～39 岁，平均年龄为（31.3±5.4）岁，平均BMI 为（22.65±3.18）kg/m2，其中3 例患者有吸烟史；C 亚组患者年龄为21～39 岁，平均年龄为（30.6±4.7）岁，平均BMI 为（23.05±2.90）kg/m2，其中2 例患者有吸烟史。3 组患者均无手术及肿瘤史。3组患者在年龄、BMI、吸烟、手术及肿瘤史等方面的差异均无统计学（P>0.05）。

2.2 3 组血清氧化应激水平及SIRT1 水平及活性比较C 亚组血清SOD 活性较A 和组B 亚组显著下降，B亚组与A 组血清SOD 活性差异无统计学意义（P>0.05）；B 亚组和C 亚组血清GSH-Px 活性降低，但是B 亚组与C 亚组差异无统计学意义（P>0.05）；C 亚组血清MDA 活性升高。B 亚组和C 亚组血清SIRT1 水平及活性下降，并且C 亚组血清SIRT1 活性明显低于B 亚组。结果 表明POI 患者体内氧化应激水平明显改变，并且随着卵巢功能显著下降，改变更加明显；血清SIRT1 含量及活性也显著下降。见图1。

2.3 POI 患者血清氧化应激水平与SIRT1 相关性分析血清SOD 活性与血清SIRT1 含量及活性呈正相关（r=0.36，P=0.0005；r=0.22，P=0.04），血清GSH-Px活性与血清SIRT1 含量及活性正相关（r=0.36，P=0.0006；r=0.30，P=0.004）,血清MDA 活性与血清SIRT1 含量及活性负相关（r=-0.49，P<0.0001；r=-0.24，P=0.02）。见图2。

2.4 氧化应激对卵巢颗粒细胞功能影响 H2O2干预的KGN 细胞组ROS 水平升高，MMP 水平降低，细胞凋亡增加，其中，100mol/L 的H2O2干预组最为显著。因此，最终选择100mol/L 的H2O2为最终造模浓度。Western Blot 结果显示氧化应激损伤KGN 细胞模型组SIRT1 表达水平显著降低，颗粒细胞表面功能性受体FSHR、AMHR2、LHR 表达明显下降，同时雌二醇（estradiol，E2）、抗缪勒管激素（Anti-mullerian hormone，AMH）合成及分泌能力降低。结果 说明氧化应激可能通过SIRT1 参与调控颗粒细胞表面受体表达及激素合成能力，影响颗粒细胞成熟、生长及发育，进而影响卵巢功能。见图3～4。

3 讨论

早发性卵巢功能不全（即卵巢早衰）病因复杂，常见病因包括遗传因素、医源性因素(如手术、放化疗和药物损伤)、免疫因素(如自身免疫性甲状腺疾病、Addison 病)以及环境因素等，但临床上仍有50%以上的POI 患者病因不明确，目前尚无有效的治疗方法[4]。2020年刘光慧等[5]通过单细胞测序发现在卵巢衰老过程中卵母细胞及颗粒细胞氧化损伤增加，伴随着促凋亡基因表达上调、氧化还原酶相关基因表达下调，并且发现氧化应激相关转录因子在卵泡发育不同阶段中起着重要作用。始基卵泡的闭锁或消耗过速，卵巢储备功能耗竭，是POI 发生发展的病理生理转归，可能与氧化应激等原因造成的卵巢直接损伤，血管减少，间质纤维化，卵泡发育信号通路失衡等有关，具体机制尚不明确[6-9]。因此，研究POI 的病因及其发生机制对于临床上POI 的治疗具有至关重要的意义。

图1 3 组血清氧化应激水平及SIRT1 水平及活性比较

图2 POI 患者氧化应激水平与SIRT1 相关性分析

本实验发现，POI 患者血清SOD、GSH-Px 活性下降，MDA 活性上升，并且随着POI 患者卵巢功能下降，血清SOD、GSH-Px 活性下降更加显著，MDA活性上升更加显著，说明POI 的发生与氧化应激相关，并且POI 疾病严重程度与氧化应激损伤程度相关。此外，POI 患者血清SIRT1 水平降低，SIRT1 活性下降，进一步研究发现血清SOD 活性、GSH-Px 活性与血清SIRT1 含量及活性呈正相关，MDA 活性与血清SIRT1 含量及活性呈负相关。SIRT1 作为线粒体动力学的调节因子，多项研究提示SIRT1 参与氧化应激过程，在胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝性疾病、神经退化性疾病研究中，激活SIRT1 信号通路可以减少脂多糖诱导的ROS 生成，而SIRT1 抑制剂可抑制这种保护作用[10-12]。SIRT1 水平的高低在一定程度上可以反映血清氧化应激水平状态，进一步说明氧化应激参与POI 致病过程。

图3 氧化应激损伤KGN 模型建立

图4 氧化应激影响卵巢颗粒细胞功能

本研究的细胞实验发现，氧化应激损伤KGN 细胞中SIRT1 表达降低，颗粒细胞表面功能性受体FSHR、LHR 及AMHR2 表达降低，颗粒细胞E2 及AMH 合成及分泌能力降低，SIRT1 对卵巢颗粒细胞发育及功能具有重要调控作用，氧化应激可能通过SIRT1 影响颗粒细胞功能参与POI 的发生过程。FOXOL2基因在卵巢的分化维持及功能中具有重要作用，FOXOL2 突变表现为人睑裂狭小综合征，I 型患者伴有卵巢功能不全。氧化应激状态下，颗粒细胞内FOXL2表达激活，可诱导下游FOXO 信号转导，促进卵巢分化相关基因表达，同时促进SIRT1 表达升高，负反馈调控FOXL2 的表达[13]。FOXL2 表达过度激活可导致颗粒细胞功能损伤，激素分泌减少，排卵障碍，从而导致POI 的发生发展[14]。抗氧化剂褪黑素通过激活SIRT1 表达，促进PI3K-AKT 通路介导的FOXO1 去乙酰化修饰，抑制氧化应激诱导的卵巢颗粒细胞自噬，提示SIRT1 可能是抗氧化应激作用改善POI 小鼠卵巢功能的潜在作用靶点[15]。

综上所述，氧化应激可能通过SIRT1 参与POI发生，改善低雌激素状态及维持卵泡发育及功能，由于SIRT1 广泛表达于人体各个组织中，SIRT1 与多种信号传导通路相互作用，参与神经保护、细胞衰老调控、糖脂代谢及炎症免疫等过程。SIRT1 相关信号通路研究有助于探索POI 发生机制，但其应用于POI治疗仍需进一步的实验研究。但是本实验存在一定的局限性，首先，外周血中的氧化应激及SIRT1 水平影响因素很多，外周血不能代表卵巢组织中的氧化应激状态及SIRT1 变化，卵泡液在一定程度上更能反应卵巢氧化应激状态，后续将从生殖中心收集POI 患者取卵时的废弃卵泡液；其次，由于伦理学限制以及人颗粒细胞来源困难，实验采用KGN 细胞系，KGN 来自于人卵巢颗粒细胞瘤，并不是真正的原代细胞，不能准确评价氧化应激功能，后续将增加正常人群黄素化颗粒细胞的培养及相应的分子实验；此外，H2O2处理的KGN 细胞不能代替POI，后续仍需进一步动物试验验证氧化剂是否能引起小鼠POI 表型改变，线粒体作为氧化应激发生的主要场所，而SIRT1 在细胞核表达，其如何调控线粒体分子，具体作用机制如何，这些问题仍需后续的实验研究来阐明。