间充质干细胞来源胞外囊泡在新型冠状病毒肺炎中的潜在应用价值

杨琛，王利，张瑞，李春峰，冷同爱

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）自暴发以来迅速蔓延[1]，目前已成为全球公共卫生事件。截至2020年12月，全球累计确诊COVID-19患者8 000余万例，累计死亡患者170余万例。危重型COVID-19患者死亡率较高，其中免疫系统过度激活引起的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）及多器官功能衰竭是其死亡的主要原因之一[2-3]。目前，COVID-19的治疗仍以抗病毒、免疫调节、支持治疗为主[4]，暂无特效治疗方法，故探寻安全、高效的治疗策略迫在眉睫。

间充质干细胞来源胞外囊泡（mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles，MSC-EV）能够选择性聚集间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源的蛋白、mRNA、微小RNA（miRNA）、细胞因子、脂质等物质，并靶向投递其内容物至目标细胞，进而发挥抗微生物、抗炎、免疫调节、组织修复、促血管生成、抗纤维化等作用，在免疫相关疾病及再生医学中发挥着重要作用[5-6]。理论上，MSC-EV能够促进SARS-CoV-2清除，抑制患者过度激活的免疫状态，并促进受损组织、器官修复。此外，MSC-EV在保留MSC免疫调节及组织修复等功能的同时[7]还能够规避MSC作为细胞组分相关的一些不良反应[6]。本文主要综述了MSC-EV在COVID-19中的潜在应用价值，以期为COVID-19患者提供一种安全、高效的治疗策略。

1 COVID-19发病机制

SARS-CoV-2通过棘突蛋白与Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、内皮细胞等细胞表面的血管紧张素转换酶2受体结合并进入宿主细胞[8]，病毒RNA释放入细胞内并转录病毒相关组分，进而引起宿主细胞损伤甚至死亡。SARS-CoV-2结构蛋白在宿主细胞内形成并组装完成病毒复制，经过胞吐作用从宿主细胞内释放出来，并通过呼吸道飞沫等途径迅速在人群中传播。SARS-CoV-2能激活机体固有及适应免疫应答。固有免疫系统的干扰素（interferon，IFN）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞可识别病原体相关分子模式并引起细胞毒免疫反应，形成抗SARS-CoV-2的第一道防线。SARS-CoV-2可激活免疫细胞，而活化的细胞毒性T淋巴细胞及B淋巴细胞是适应免疫应答的主要参与者，可分别破坏病毒感染细胞、产生抗体并清除病毒。

众所周知，机体的适应免疫应答在清除SARS-CoV-2方面发挥着积极作用，但不被控制的固有炎性反应及受损的适应免疫应答常会导致负面影响。研究表明，SARS-CoV-2可使CD4+T淋巴细胞分化为辅助性T（helper T，Th）1细胞，危重症患者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及调节性T细胞明显减少[9]，CD14+CD16+单核细胞、Th17细胞及表达穿孔素、颗粒酶的CD8+T淋巴细胞增多[10]，白介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IFN-γ诱导蛋白10、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、MCP-3、 巨 噬 细 胞 炎 症 蛋 白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、单核因子诱导IFN-γ、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎性细胞因子水平明显升高并形成细胞因子风暴[9，11-12]，细胞因子及趋化因子募集大量中性粒细胞及巨噬细胞并在肺部浸润、释放有毒递质，引起肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤及通透性增加，炎性细胞及大量液体渗透至肺泡内及肺泡间隙，可导致纤维组织沉积、透明膜形成及肺泡壁弥漫性增厚[10，13]。研究表明，SARS-CoV-2所致的细胞因子风暴可引起心脏、肝脏、肾脏等多器官功能损伤甚至衰竭[14]，严重时甚至导致患者死亡[3]。

2 MSC-EV治疗COVID-19的潜在作用机制

2.1 MSC-EV可促进病毒及细菌清除 MSC-EV可增强机体抗微生物作用，理论上能促进SARS-CoV-2清除。MSC-EV能够投递RNA至肺上皮细胞，阻止流感病毒复制并抑制其红细胞凝集，进而抑制病毒引起的细胞凋亡[15]。在猪流感模型中，MSC-EV能够明显减少猪鼻拭子及肺部病毒载量，减轻流感病毒引起的急性肺损伤[15]。在细胞实验中，MSC-EV能够通过投递 let-7f、miRNA-145、miRNA-199a、miRNA-221等miRNA至靶细胞而阻止丙型肝炎病毒复制[16]；MSC-EV能通过投递线粒体至巨噬细胞而上调其氧化磷酸化水平并增强巨噬细胞的吞噬功能[17-18]。在小鼠大肠埃希菌肺炎模型中，MSC-EV通过投递miRNA-145而抑制多药耐药相关蛋白1 RNA及蛋白表达，促进白三烯B4的产生[19]，增强单核细胞及中性粒细胞吞噬功能及抗菌活性，减少小鼠肺部细菌含量并降低菌血症发生风险，进而有效减轻肺炎严重程度[7，19]。

2.2 MSC-EV可促进病毒及细菌感染所致肺损伤的修复与免疫调节 SARS-CoV-2感染后患者免疫系统过度激活，从而引起ARDS。理论上MSC-EV能够通过多种免疫调节机制而抑制COVID-19患者免疫系统激活，从而改善患者肺内皮及上皮细胞通透性，加快肺泡液的清除，促进患者肺部炎症的消失。MSC-EV能够投递环氧化酶2 mRNA、线粒体至靶细胞，促进前列腺素E2分泌、诱导巨噬细胞由促炎症的M1表型向抗炎症的M2表型极化[7，17，20]，抑制T淋巴细胞及中性粒细胞功能，并促进抗炎性细胞因子的分泌。MSC-EV能够投递mRNA、miRNA等物质，减少肺部中性粒细胞、巨噬细胞的浸润[7，21]，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等促炎性细胞因子的分泌，促进IL-10、转化生长因子β等抗炎性细胞因子的分泌[7，20-24]，从而减轻流感病毒引起的急性肺损伤[15]。此外，MSC-EV还能诱导Th1细胞转化为Th2细胞，减少T淋巴细胞分化为Th17细胞，同时增加调节性T细胞[22]，减少肺泡液中蛋白及MIP-2含量，减轻肺水肿及内皮细胞通透性，从而降低大肠埃希菌所致肺炎小鼠的死亡率[7，18]。在小鼠ARDS模型中，MSC-EV可通过投递血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）mRNA至靶细胞而上调Ang1表达[20]，减少中性粒细胞浸润并降低MIP-2水平，进而发挥抗炎及保护内皮细胞功能、改善肺毛细血管通透性的作用[21]。在体外人肺大肠埃希菌重症肺炎模型中，MSC-EV能降低肺内皮细胞蛋白通透性、加快肺泡液的清除，减少肺泡内细菌数量，从而减轻大肠埃希菌引起的肺损伤[25]。

2.3 MSC-EV可促进受损组织、器官的修复 SARS-CoV-2常引起患者组织、器官功能损伤，甚至发生多器官功能衰竭，这也是危重型COVID-19患者死亡的主要原因之一。理论上MSC-EV能够促进COVID-19患者受损组织、器官修复，改善患者预后，可能的机制如下：MSC-EV表达的分化群（cluster of differentiation，CD）29、CD44、CD73等黏附分子能归巢至损伤组织部位并发挥作用[6]；MSC-EV能够投递新陈代谢关键酶、功能性线粒体等物质至受损组织，增强肺泡上皮细胞线粒体功能及修复能力[17]，进而修复大肠埃希菌引起的肺泡上皮细胞损伤[7]；MSC-EV能够投递miRNA-21-5p并发挥抗细胞凋亡作用，减轻氧化应激诱导的肺上皮细胞死亡[24]；此外，MSC-EV还能通过投递Ang1 mRNA至内皮细胞而促进Ang1分泌，修复IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子引起的内皮细胞损伤，改善肺毛细血管通透性[26]。有动物实验结果显示，MSC-EV通过调节单核巨噬细胞群而减少胶原沉积，预防及修复博来霉素引起的肺纤维化[23]。MSC-EV通过产生角质细胞生长因子、血管内皮生长因子、HGF等一系列生长因子[6-7，27]而在心肌梗死、肝损伤、肾损伤、神经系统损伤等方面表现出良好的组织修复作用[6，28]。

3 MSC-EV治疗COVID-19的现状

MSC-EV具备促进病原体清除、免疫调节、促进损伤的肺及其他组织、器官修复等作用，其在保留MSC作用的同时还能避免MSC相关不良反应，如不存在不受控制增殖及异位分化的风险。COVID-19患者常表现为高凝状态，而MSC可表达组织因子并主要在肺毛细血管聚集，可能增加肺栓塞等血栓栓塞事件发生风险。而MSC-EV体积较小，易通过血管等物理屏障；此外，MSC-EV免疫原性低，其脂质双分子层包膜能够有效避免内容物被循环中的酶类等物质降解，具有良好的生物相容性和稳定性，故直接将药物或miRNA等小分子物质装载到MSC-EV内并通过其归巢作用，有望在药物投递载体方面发挥一定作用。上述优势使MSC-EV在COVID-19治疗中具有一定潜力。

笔者以“COVID-19”“间充质干细胞外泌体”“间充质干细胞胞外囊泡”“MSC exosomes”“MSC extracellular vesicles”为关键词，检索国内外临床试验数据库，共检索到MSC-EV治疗COVID-19的临床试验共4项，包括国内临床试验3项，其中MSC外泌体雾化吸入治疗COVID-19的关键技术研究（ChiCTR2000030261）为随机对照研究，但MSC外泌体具体干预措施尚未报道；MSC外泌体雾化吸入治疗COVID-19的初步临床研究（NCT04276987）为单臂临床试验，患者雾化吸入2.0×108个MSC外泌体，1次/d，疗程为5 d；脐带MSC联合细胞外泌体静脉输注对COVID-19肺损伤修复的临床应用研究（ChiCTR2000030484）为随机对照研究，干预组患者静脉输注180 mg MSC外泌体，1次/d，共治疗14 d，联合静脉输注5×107个MSC，1次/周，共两次。国外临床试验1项，为MSC外泌体雾化吸入治疗SARS-CoV-2相关性肺炎的安全性和有效性评价（NCT04491240），试验设计为随机对照研究，MSC外泌体组患者雾化吸入（0.5～2.0）×1010个MSC外泌体，2次/d，疗程为10 d。

已发表的1项前瞻性临床研究结果显示，24例危重型COVID-19患者接受1次骨髓来源MSC-EV静脉注射后，19例（79.2%）患者临床症状及氧合状态明显改善，17例（70.8%）患者临床痊愈，3例（12.5%）患者仍危重但病情稳定，患者平均治疗5.6 d后出院，该组患者存活率为83.0%（20/24）；此外，该组患者治疗后CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞绝对值明显升高，中性粒细胞绝对值明显降低，C反应蛋白、铁蛋白、D-二聚体水平明显降低，治疗及随访期间未发现不良事件发生，初步提示MSC-EV治疗COVID-19患者是安全、有效的[29]。

4 小结与展望

SARS-CoV-2可引起患者免疫系统过度激活，导致ARDS及后续多器官功能损伤甚至衰竭，是COVID-19患者病情进展及死亡的重要原因。理论上MSC-EV能够促进SARSCoV-2清除，抑制机体免疫系统过度激活，减轻炎性反应尤其是细胞因子风暴导致的肺泡上皮及血管内皮损伤，并通过组织修复作用而促进损伤的肺及其他组织、器官的功能恢复。此外，MSC-EV还具有良好的生物相容性和稳定性，能够避免MSC相关不良反应。有临床试验初步显示，MSC-EV治疗COVID-19患者是安全、有效的[29]，其可能成为COVID-19的潜在治疗策略。

但MSC-EV用于COVID-19患者的治疗中仍有许多前期工作需要完成，尽管国际胞外囊泡协会对胞外囊泡的分离、纯化、鉴定等做出一些基本要求[30]，但不同研究间的实验流程仍存在差异，胞外囊泡的异质性及复杂性对实验结果的解读及进一步临床试验有一定影响。MSC细胞接触方式与旁分泌机制在其发挥作用时均起关键作用，故单独应用MSCEV能否达到MSC同等功效仍有待进一步研究。此外，MSCEV组织来源、母体细胞代数、内容物构成差异、是否需要预处理[7，18]及使用时机、剂量、频次、途径等因素对MSC-EV作用的具体影响均有待进一步研究[6]。目前MSC-EV治疗COVID-19尚处于临床试验阶段，其具体疗效及安全性尚有待高质量临床试验进一步验证。

作者贡献：杨琛、王利、冷同爱进行文章的构思、设计及可行性分析，论文及英文的修订，并负责文章的质量控制及审校；杨琛、王利、张瑞、李春峰进行文献/资料收集、整理；冷同爱对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。