内质网应激与酒精性肝病研究进展

于泓洋 宋远航 赵 亮 刘天琦 鲍秀琦

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154000)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是长期过量饮酒引起的慢性肝病。在全世界范围内，酒精性肝病即病毒性肝炎之后，成为肝脏损害的第二大主要病因[1]。在2011年世界卫生组织的报告中显示,长期饮酒每年导致约260万人死亡,大多与ALD相关[2]。

ALD包括轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化等类型。内质网应激损伤、氧化应激损伤、硝化反应和调脂因子共同参与ALD发病。内质网应激在酒精性肝病发病机制有举足轻重的位置。摄入乙醇的九成在肝脏中代谢，肝脏代谢乙醇主要方法是通过胞浆中的乙醇脱氢酶，乙醛通过乙醛脱氢酶(ALDH)进行代谢。乙醛蛋白加合物和DNA加合物使酶失活，从而导致DNA修复蛋白功能障碍，蛋白功能受损，脂质过氧化和线粒体损伤，这些会使肝细胞死亡或者凋亡[3]。长时间过量饮酒会导致机体内促氧化剂的增多和抗氧化剂的减少,肝脏发生氧化应激(ROS)，最终导致肝细胞的死亡或凋亡。乙醇会增加肝细胞中的ROS，从而消耗大量抗氧化剂并加剧肝脏损害。 ROS对蛋白质的氧化修饰会降低其活性，引起结构变化，例如蛋白质的部分展开和疏水基团的暴露，最终导致蛋白水解和诱导内质网应激[4]。

1 ER与ERS

内质网(ER)是重要的细胞器，它的功能包括蛋白质合成与折叠、组装与运输，同时它也是储存钙的主要场所，细胞内脂类代谢和类固醇激素的合成也在此地。然而，当折叠错误蛋白或未折叠蛋白(UPR)在内质网内大量积累，或钙在内质网中流失，内质网的功能就会受损，这种情况被定义为内质网应激(ERS)[5]。内质网无法恢复其功能时，那么细胞死亡途径就会被激活，出现炎症反应。酒精代谢可导致多种蛋白质加合物的形成，以及损害内质网中适当的蛋白质折叠，导致错误折叠蛋白堆积和内质网应激[6]。细胞可以通过激活UPR来适应内质网应激。一方面，UPR通过降低蛋白翻译和增加蛋白折叠能力(通过促进伴侣蛋白的表达)减轻内质网应激并恢复内质网稳态。另一方面，UPR还通过蛋白酶体的内质网相关蛋白降解(ERAD)或内质网应激介导的代偿性自噬促进错误折叠蛋白的降解。然而，长期饮酒可抑制肝脏蛋白酶体活性，使折叠错误的蛋白质在细胞内积累，形成不溶性蛋白聚集体，抵抗蛋白酶体的降解[7]。

内质网应激激活三种跨膜蛋白——活化转录因子6(ATF6)、肌醇需求酶1(IRE1)和R样内质网激酶(PERK)——它们共同诱导未折叠蛋白反应(UPR)，涉及基因的转录和翻译调控，有助于扩大内质网的处理能力并使细胞器恢复体内平衡。内质网中常见的分子伴侣有葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，GRP94和HSP40，三者当中属BIP/GRP78含量最多。在非应激状态下时，GPR78这种分子伴侣蛋白和内质网应激感受蛋白结合为复合物，处于无活性状态。应激状态下时，累积下来的非折叠蛋白将跟IRE1、PERK、ATF6竞争GRP78的结合，使得IRE1、PERK、ATF6解离并激活从而促进蛋白的水解。PERK被认为是UPR信号中最先被激活的分子，紧接着为ATF6， IRE1被认为是最后激活的分子[8]。除了3条基本通路，在实体瘤中诱导的血管内皮生长因子(VEGF)的通路可以激活ATF6和PERK信号级联反应，IRE1α也可以被激活的RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT)激活。

1.1 R样内质网激酶(PERK)介导的生存信号途径

PERK将真核细胞翻译起始因子2α(eIF-2α)51位丝氨酸磷酸化，其作用是阻止蛋白翻译，减轻ER的负荷。为了缓解内质网中的蛋白质超负荷，磷酸化的eIF2α通过阻止80 s核糖体组装来阻止mRNA翻译，同时反常地增加在其他区域具有上游开放阅读框的几种mRNA的翻译，如ATF4[9]。然而，激活的eIF-2α对活化转录因子4(ATF4)mRNA的翻译产生诱导作用，从而激活其下游分子C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)的表达，ATF4上调CHOP基因的表达，参与到细胞凋亡、细胞应激、中枢神经系统和代谢异常等病理过程中。在哺乳动物细胞中，CHOP处于普遍表达的状态，是ERS介导细胞凋亡的主要信号分子[10]。

PERK信号级联包括几种主要蛋白组分，如eIF2α、转导蛋白(β)样2(TBL2)、核因子红系衍生2样2(Nrf2)、ATF4、CHOP和瘢痕样ECH相关蛋白1(KEAP1)。在內质网应激进程中，PERK还可以将NF-KB激活，NF-KB可以将抗凋亡蛋白Bcl-2正向调节，达到激活细胞途径的目的[11]。

1.2 肌醇需求酶1(IRE1)介导的生存信号途径

IRE1是一种具有两个功能的膜转运蛋白，它不仅具有蛋白激酶活性，还具有核酸内切酶活性，也是UPR中最保守的蛋白。最开始，IRE1基因是在筛选酿酒酵母遗传突变体时分离得到的[12]。之后发现两个哺乳动物基因IRE1α和 IRE1β，在C末端具有控制激酶和内切核糖核酸酶活性的胞浆效应器结构域，在N末端存在差异，N端具有管腔感受器结构域、单向膜转运结构域[13]。

当内质网应激的状态下，IRE1α反式磷酸化从BiP结合解离后，并激活核糖核酸内切酶(RNase)，活化的IRE1α还聚集肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子-2(TRAF2)和凋亡信号激酶1(ASK1)介导应激活化蛋白激酶(JNK)的活化和核因子κB的活化[14]。激活后的 IRE1α催化X-盒结合蛋白1(Xbox-binding protein 1，XBP1)的mRNA的切割，IRE1α/XBP1的主要功能是通过上调XBP1的转录因子活性和IRE1α的RNase活性，上调编码蛋白折叠、质量控制和ERAD相关蛋白的基因，促进细胞存活[15]。

1.3 活化转录因子6(ATF6)转录诱导的生存信号途径

ATF6是Ⅱ型内质网跨膜蛋白，具有三个结构域：管腔的C末端结构域，膜转运结构域和细胞质的N末端结构域[16]。其中细胞质的N末端在其结构中包含亮氨酸拉链(bZIP)结构域，它可以在内质网上是因为和伴侣GRP78/BiP和钙网蛋白相互结合。 在ERS中，ATF6从内质网迁移到高尔基体，并通过位点1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)调节膜内蛋白水解[17]，释放ATF6的N-末端部分，N-末端蛋白作为转录因子转位至细胞核，通过与ATF(激活转录因子)/cAMP反应元件(CRE)和内质网应激反应元件(ERSE)结合激活转录，增加XBP1-、BiP/GRP78-、CHOP-、PDI-和ERAD相关蛋白转录[18]。

2 内质网应激与肝细胞凋亡

酒精性肝病凋亡的病理学金标准是肝细胞中嗜酸性粒细胞的形成，嗜酸性粒细胞和Mallory体在同一细胞内。 目前存在三种主要类型的细胞凋亡：外源途径(受体介导)、内源途径(线粒体介导)和ERS介导的途径[19]。ERS导致细胞凋亡的途径包括: (1)诱导PERK/eIF2α依赖的促凋亡转录因子CHOP激活; (2)IRE1介导的肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)激活, 其刺激凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)激酶级联;(3)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)通路的激活[20]。

2.1 CHOP与细胞凋亡

当ERS后PERK-eIF2α-ATF4使之大量活化，ATF4激活CHOP基因转录，CHOP基因包含与未折叠蛋白相关的结合位点(如ATF4，ATF6和XBP1)，并且可以通过在未折叠蛋白过程中调节编码来促进细胞凋亡[21]。CHOP可能诱导细胞凋亡的途径: (1)CHOP诱导凋亡可能是通过诱导BCL-2家族抗凋亡蛋白的表达下调，使两个凋亡蛋白BCL-2和Bax不平衡，进而增加Bax的表达量，增多的游离Bax转运至线粒体，诱导线粒体途径凋亡[22]。(2)CHOP转录增强GADD34的表达，激活了elF2α的蛋白质去磷酸化逆向翻译抑制[23]。使蛋白质量产变多产生ROS，内质网蛋白质过多导致细胞凋亡。(3)CHOP以ER氧化酶1α(ERO1a)依赖性方式介导细胞凋亡，导致Ca2+从ER释放，随后Ca2+进入线粒体，在线粒体内发生去极化进而产生多余的ROS，内质网应激诱导氧化应激同时使线粒体失去功能，导致细胞凋亡(内源途径)[24]。内质网蛋白错误折叠与ROS产生之间存在密切关系。

2.2 Caspase-12与细胞凋亡

在正常状态下，肿瘤坏死因子受体相关因2(TRAF2)与Caspase-12前体形成结合成复合物，持续的内质网应激时Caspase-12前体与TRAF2分离，从而激活Caspase-12[25]。ERS作用下，然后Caspase-7在Asp94和Asp31处切割Caspase-12前体，使它活化。活化的Caspase-12激活Caspase-9进而激活Caspase-3,最终诱导细胞凋亡的发生[26]。此外，Ca2+浓度的升高刺激需钙蛋白酶(calpain)，也会促使Caspase12向细胞质转位，进而使其活化。

2.3 JNK与细胞凋亡

IRE1a激活TRAF2，随后激活细胞凋亡信号激酶1(ASK1)和JNK。JNK磷酸化诱导的促凋亡Bim活化和抗凋亡Bcl2蛋白失活， 介导的细胞凋亡[27]。JNK过度表达会让内质网膜受到损伤，Ca2+外流，通过分解酶激活Caspase12，进而使细胞进入凋亡状态。此外，JNK还会上调p53凋亡基因表达，同时编码许多因子，例如c-Jun，c-Fos和EIK-1并诱导配体的表达，例如肿瘤坏死因子和Fas-L[28]。

3 酒精性肝病与内质网应激

许多研究证明同型半胱氨酸(Hcy)代谢、氧化应激、乙醛加合物等途径诱导ERS。血液中Hcy升高，这种被称为高同型半胱氨酸血症(HHcy)。胃内酒精喂养显示小鼠血浆Hcy增加5倍以上，HHcy是包括心血管疾病、糖尿病和酒精性肝病在内的几种疾病的组成部分[29]。HHcy增强NF-kB、IL-1b、IL-6和IL-8的产生，诱导内质网应激，这可以解释Hcy-促进细胞损伤的许多过程，如细胞凋亡，脂肪堆积和炎症，这些基因的表达与蛋白质折叠不良以及细胞凋亡和脂质合成相关，Hcy 可以激活GRP78、CHOP、IRE1α、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)和JNK等通路[30]。乙醇摄入过多会形成加合物，如丙二醛-乙醛杂化物和α-羟乙基蛋白加合物。研究表明丙二醛-乙醛加合物增加了IRE1、eIF-2α、GRP78和CHOP的诱导。此外，在急性乙醇中毒的小鼠模型中，对抗利尿激素的抑制作用可能导致葡萄糖调节蛋白78 mRNA水平的下调[31]。 这表明肝脏代谢乙醇ERS之间存在因果关系。据报道，通过灌胃输注乙醇4周后，我们观察脂肪性肝炎、肝脏S-腺苷甲硫氨酸(SAM)降低、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)升高和SAM/SAH比值降低，GRP78、ATF4、CHOP、SREBP-1c上调，并与酒精诱导的SAM/SAH比值呈负相关[32]。动物长期灌胃输注酒精，肝细胞内细胞色素CYP2E1过表达可增加超氧化物歧化酶(SOD)的表达，激活核因子红系2相关因子2(Nrf2)，Nrf2是内质网应激反应因子。

4 结语

ALD发病机制有很多， ERS在ALD中起重要作用。虽然酒精诱导的ERS机制的认识有了进步，但是还有待进一步探索。这样才能研制出疗效更好的药品，也将有助于做好ALD的防治工作。