中国明对虾低温下显著上调表达抗凋亡与免疫相关类基因的筛选分析

闫潆心　李裕强　张梦茹　裴若怡　吴玉妹

摘要：为了筛选出中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）低温下显著上调表达的基因，揭示中国明对虾耐低温分子调控机制。利用DEseq2方法对3种类型中国明对虾常温和低温转录组进行差异表达基因（differential expression genes，DEG）检测，筛选出6条低温下显著上调表达的抗凋亡与免疫相关类基因。并运用生物信息学的分析方法，分析这些基因的表达产物，功能性状，以及低溫上调表达的原因。研究结果显示，6条中国明对虾低温上调表达基因的编码产物包括：发挥分子伴侣作用的HSP70、HSP20、DEAD-box RNA解旋酶，发挥抗凋亡作用的Pim-1激酶和富甘氨酸蛋白以及发挥免疫作用的丝氨酸蛋白酶。本研究筛选并鉴定了中国明对虾耐低温相关基因，揭示了其耐低温胁迫下分子调控机制，以期为中国明对虾耐低温品系育种工作的改良提供参考。

关键词：中国明对虾;耐低温性状;分子伴侣;抗凋亡;免疫力

中图分类号：S968.2        文献标识码：A

中国明对虾是我国重要的水产资源，温度是影响其生长发育的重要因素，4℃～38℃为中国明对虾的水温耐受范围，最佳生长温度为25℃，且放苗温度不可低于14℃[1]。对低温的不耐受导致中国明对虾冬季的养殖工作艰难，成活率下降，养殖成本大幅上升，最终影响了经济效益。因此，对中华明对虾耐低温相关基因进行研究，选育出耐低温且生长速度较快的优良新品种，对中国明对虾的资源保护十分重要。国内外对于水产动物耐低温相关基因的研究已有很多，如：孟宪红等[1]人利用高通量转录组测序筛选出中国明对虾的谷胱甘肽转移酶等5条低温上调表达基因，并利用RT-PCR技术验证其研究结果。但是目前有关中国明对虾抗寒基因的研究还不够全面，许多耐低温相关因子及其基因还未被注释。本研究分析了低温诱导下野生和选育中华明对虾的转录组序列，从中筛选出其中在6个以上比较组中重复出现，上调差异表达且表达量FPKM≥100的基因。本文对其中发挥分子伴侣，抗凋亡和提高免疫作用的基因进行了生物信息学分析并注释，为揭示中国明对虾的抗寒分子调控机制提供更多基础数据，从而为中国明对虾低温育种提供了更多分子层面的理论支持。

1  材料与方法

1.1  材料

中国明对虾选育组来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖遗传育种中心即墨鳌山卫实验基地（纬度：36°20′32.22″N，经度：120°39′1.93″E），28℃恒温水域养殖，随机选取35尾G15代（共94个家系）的仔虾。野生组以渤海海域捕捞的野生中国明对虾为亲虾，于山东大学（威海）养殖中心（纬度：37°31′42.96″N，经度：122°3′52.74″E）人工培育虾苗（水温18℃），随机选取35尾。

1.2  方法

1.2.1  取样

分别选取野生和选育的中国明对虾幼虾进行低温诱导，与常温组进行比对，对比较组中中国明对虾样本进行转录组测序。

样本包括：10日龄野生常温幼虾（P10YC）、10日龄野生低温诱导幼虾（P10YD）、40日龄选育常温幼虾（P40XC）、40日龄选育低温诱导幼虾（P40XD）、40日龄野生常温幼虾（P40YC）、40日龄野生低温诱导幼虾（P40YD）。

1.2.2  差异表达基因/转录本筛选

根据DEseq2方法进行差异表达基因检测。定义差异倍数为两倍以上并且矫正后的p-value≤0.001的基因，筛选为显著差异表达基因。

进一步筛选出其中上调差异表达并且表达量FPKM≥100的基因。最终共在以下9个常、低温比较组中，筛选出32个符合上述条件的基因。

在这32个基因中，共有23个基因在6个比较组之间共同存在，即在6个比较组中都显著上调差异表达，本文对其中发挥分子伴侣，抗凋亡和提高免疫作用的6条基因进行生物信息学分析，包括：CL975.Contig1_All、CL4921.Contig1_All、CL234.Contig15_All、CL804.Contig4_All、Unigene472_All、Unigene5751_All

1.2.3  生物信息学分析

利用GenBank数据库中的blast程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行基因序列比对，找寻相似度高的序列。

利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）进行氨基酸序列的相似性比对，找寻基因所编码的蛋白质。

利用ORF氨基酸序列检索数据库Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析蛋白结构域。

经过以上的检索工作，仍有部分序列无法获取其产物信息，此时利用PSIPRED Workbench（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/），对上述操作中获得的ORF序列所编码蛋白的结构和功能进行预测。

2  结果与分析

2.1  分子伴侣相关基因

2.1.1  CL975.Contig1_All

转录本CL975.Contig1_All长2714nt，与Genbank数据库已知注释中国明对虾 HSP70 mRNA（FJ167398.1）序列有82.21%一致度。Pfam分析表明，234-2162区段的ORF与HSP70结构域（PF00012）呈现显著的相似性。由此，判断CL975.Contig1_All 编码中国明对虾的 HSP70 （Heart shock protein 70）。

2.1.2  Unigene5751_All

转录本Unigene5751_All长1076nt。Pfam分析表明，935-132的ORF与HSP20家族结构域（PF00011）呈现非显著相似。Interpro分析表明ORF13的130-255区段编码含有267个氨基酸的HSP20-like_chaperone（IPR008978）。

基于以上信息，判断Unigene5751_All可能编码中国明对虾的HSP20 （Heart shock protein 20）。

2.1.3  CL234.Contig15_All

转录本CL234.Contig15_All长2138nt，与GenBank数据库已知注释南美白对虾DEAD-box RNA解旋酶基因（KT122790.1）序列有97.01%一致度。Pfam分析表明，134-1690区段的ORF与DEAD/DEAH box解旋酶结构域（PF00270）呈现显著的相似性。由此，判断CL234.Contig15_All 编码中国明对虾的DEAD-box RNA解旋酶（DEAD-box RNA helicases）。

2.2  抗凋亡相关基因

2.2.1  CL804.Contig4_All

转录本CL804.Contig4_All长1746 nt，与GenBank 数据库已知注释南美白对虾丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim-1基因（KY386849.1）序列有96.65%一致度。Pfam分析表明，1624-521区段的ORF与蛋白激酶结构域（PF00069）呈现显著的相似性，已知Pim-1激酶含有此结构域[2]。由此，判断CL804.Contig4_All 编码中国明对虾的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim-1蛋白（Pim-1 proto-oncogene， serine/threonine kinase）。

2.2.2  CL4921.Contig1_All

转录本CL4921.Contig1_All长814nt。Pfam分析表明，18-329区段的ORF与富甘氨酸蛋白结构域（PF07172）有非显著相似性。结合PSIPRED预测，分析其编码产物为一种跨膜蛋白，结合核酸或受体发挥作用，推测其可能是富甘氨酸蛋白（Glycine rich protein，GRP）基因表达产物。

2.3  免疫相关基因

2.3.1  Unigene472_All

转录本Unigene472_All长1411nt，与Genbank数据库已知注释中国明对虾丝氨酸蛋白酶有93.83%的一致度。Pfam分析表明，43-1227区段的ORF与丝氨酸蛋白酶结构域（PF18322）呈现显著的相似性。由此，判断Unigene472_All编码中国明对虾的丝氨酸蛋白酶（serine protease）。

3  讨论

温度是影响中国明对虾生长发育的重要因素，因此，找寻与中国明对虾耐低温性状相关的基因，并通过分子育种技术实现耐低温新品种的高效选育具有重要意义。

本研究分析了低温诱导下野生和选育中华明对虾的转录组序列，筛选出其中在6个以上比较组中重复出现，上调差异表达且表达量FPKM≥100的基因，其编码产物包括：发挥分子伴侣作用的HSP70、HSP20和DEAD-box RNA解旋酶，发挥抗凋亡作用的HSP70、Pim-1激酶和富甘氨酸蛋白，以及发挥提高免疫作用的丝氨酸蛋白酶。

3.1  分子伴侣相关基因

3.1.1  HSP70

转录本CL975.Contig1_All经鉴定编码HSP70。

热休克蛋白是一类机体在应急状况下产生的保护性蛋白，在水生动物适应逆境胁迫中起着重要的作用[3]。HSP70属于热休克蛋白家族中的重要成员，其分子量约为70kD。

经分析，在中国明对虾耐低温胁迫方面，HSP70主要从三个方面发挥其分子伴侣功能，其中最主要的是帮助新合成肽链的折叠：在ATP的协助下，HSP70可以与未折叠肽链的疏水区结合，防止其在低温下发生折叠错误或聚集，以维持蛋白质分子的正确构型。次要功能包括：在低温胁迫下帮助蛋白质跨膜运输和修复受损的蛋白質，从而维持细胞在低温下的生理活性[4]。

3.1.2  HSP20

转录本Unigene5751_All经鉴定编码HSP20。

HSP20属于小分子热休克蛋白家族（smHSP family），是普遍存在且保守性最差的热休克蛋白家族。

经分析，HSP20在中国明对虾适应低温胁迫中主要起到：以分子伴侣的形式维持细胞蛋白稳定，进而维持细胞的正常生理状态，具体机制如下：

作为分子伴侣以维持低温胁迫下蛋白质分子的稳定时，HSP20的作用方式不同于其它热休克蛋白，其可以不依赖ATP直接行使功能[5]。它的作用方式类似于蛋白酶，通过与未折叠蛋白表明的疏水基团结合，防止其在低温胁迫下发生不可逆的聚合，还可溶解异常蛋白，维持低温下蛋白的正常结构和功能[6]。

3.1.3  DEAD-box RNA解旋酶

转录本CL234.Contig15_All经鉴定编码DEAD-box RNA解旋酶。

DEAD-box RNA解旋酶是一种由水解ATP功能催化RNA解旋的解旋酶，是参与生物冷适应的RNA伴侣，其具体作用机制如下：

mRNA构象对温度敏感，低温胁迫下，容易形成构象错误的二级结构使细胞中的翻译活动受阻。DEAD-box RNA解旋酶可以解旋这些构象错误的mRNA二级结构，并协助其形成正确的构象，确保寒冷条件下翻译活动仍能顺利进行[7]。此外，DEAD-box RNA解旋酶基因调控转录翻译的途径还包括通过自身磷酸化激活转录因子并调节下游低温效应基因的表达，是生物体内重要的抗低温胁迫调控因子[8]。

3.2  抗凋亡相关基因

3.2.1  HSP70

除分子伴侣作用，HSP70还可在中国明对虾耐低温胁迫中发挥抗凋亡作用。

HSP70抗细胞凋亡机制主要为抑制应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase， SAPK）的活性。SPKA是启动细胞凋亡程序的必需蛋白，想要触发细胞凋亡，就必须激活SAPK信号传导通路。寒冷胁迫下，HSP70可以通过阻断信号通路，抑制应激诱导的SAPK激活或抑制其活性，从而抑制细胞凋亡[9]。

3.2.2  丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim-1蛋白

转录本CL804.Contig4_All经鉴定编码Pim-1激酶。

Pim-1基因是一种高度保守的原癌基因，作用于凋亡过程的负调控。Pim-1激酶可以调控肿瘤细胞的增殖、代谢、凋亡等多个方面。

通过分析，Pim-1基因在中国明对虾适应低温胁迫中上调表达的具体机制为：当细胞接受到外界的冷刺激后，Pim-1激酶可以使一些调控第二信使的蛋白发生磷酸化，之后由第二信使把信息传递给蛋白激酶，蛋白激酶再通过催化多种功能蛋白的构象发生改变，从而调节细胞的多种生命活动以适应冷胁迫[10]，进而阻止或减少冷胁迫所导致的中国明对虾细胞凋亡，进一步提高了中国明对虾对低温环境的适应能力，使其在寒冷环境中的存活率提高。

目前，有关Pim-1的研究主要集中在癌症治疗方面，因此，有关中国明对虾Pim-1基因低温上调表达和Pim-1酶活性提高的原因还有待于进一步研究。

3.2.3  富甘氨酸蛋白

转录本CL4921.Contig1_All经分析可能编码富甘氨酸蛋白。

富甘氨酸蛋白是一种由甘氨酸高度重复序列组成的蛋白质[11]，受冷胁迫调节，在生物对低温的响应与适应中发挥着重要作用。目前，诸多关于GRP基因的研究主要集中在植物抵抗环境胁迫方面，如：李景艳等[12]利用qRT-PCR技术，检测GRP7基因在不同逆境胁迫、不同组织中的表达情况，得出盐芥GRP7基因在寒冷等逆境胁迫下会上调表达的结论。

经分析，推测GRP基因在中国明对虾适应环境胁迫中可能起到了抗细胞凋亡作用，但相关机制还未有报道，还需进一步深入探究。

3.3  免疫相关基因-丝氨酸蛋白酶

转录本Unigene472_All经鉴定编码丝氨酸蛋白酶。

丝氨酸蛋白酶是一种重要的水解酶，其以丝氨酸为活性中心，在各种生物体内广泛存在。丝氨酸蛋白酶及其同源物在无脊椎动物的先天免疫中发挥作用，具体作用方式包括：合成抗菌多肽和黑色素，促进淋巴凝血和细胞黏附等[13]。

通过分析，推测中国明对虾丝氨酸蛋白酶基因低温上调表达的原因可能为：丝氨酸蛋白酶通过参与丝氨酸蛋白酶级联反应加强对虾免疫力，在增强中国明对虾适应免疫中发挥重要作用。

4  结论

（1）本研究所筛选的6条基因在低温胁迫下显著上调表达，表明这6条基因与中国明对虾的耐低温性状有关。

（2）在中国明对虾抗低温胁迫中：CL975.Contig1_All编码的HSP70、Unigene5751_All编码的HSP20和CL234.Contig15_All编码的DEAD-box RNA解旋酶发挥分子伴侣作用，CL975.Contig1_All编码的HSP70、CL804.Contig4_All编码的Pim-1激酶和CL4921.Contig1_All编码的富甘氨酸蛋白发挥抗凋亡作用，Unigene472_All编码的丝氨酸蛋白酶发挥提高免疫作用。

（3）本研究丰富了中国明对虾的耐低温相关因子及基因，为其低温品系育种提供了更多分子层面的理论支持。但目前有关中国明对虾的耐低温基因筛选还不够全面，还有许多抗寒基因和耐低温分子机制等待科研者的探究。

参考文献

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作者简介：闫潆心（2001-），女，汉族，山东淄博人，山东大学在读本科生，研究方向：海洋药物工程。

通信作者：李裕强（1969-），男，汉族，甘肃静宁人，农学博士，山东大学副教授，研究方向：细胞生物学。