富血小板血浆来源外泌体及其组织修复作用研究进展

赵航宇，付海亮

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外一科，黑龙江 哈尔滨 150080)

富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)是一种将动物或人全血经过反复离心所获得的多功能血小板浓聚物，其血小板浓度为生理血液中的3～5倍[1]。成分包括高浓度多种类的生长因子、纤维蛋白、白细胞及炎症介质等[2]，PRP具有促进细胞增殖分化、胞外基质生成、抗炎等作用，目前已广泛应用于骨组织、软骨组织、肌腱、韧带、皮肤缺损、神经损伤及美容、生发等的再生修复治疗[3]。

外泌体(exosome)是一种双层脂质膜活性小泡，因来源细胞差异大小不一，变异范围从30～100 nm到40～200 nm不等，是生物活性蛋白、脂质、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)和微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)的载体[4]，在细胞间通讯及介导生物功能方面起至关重要的作用[5]。外泌体起源于胞内早期内小体(early endosome)，内小体膜内陷并发育成熟形成多囊体(multivesicular bodies，MVBs)，与质膜融合后通过胞吐作用释放[6]。生理条件下，几乎所有代谢活跃的细胞均能释放外泌体，并通过血液、淋巴液、脑脊液等体液系统转运至机体各处，可广泛存在于血液、唾液、脑脊液、母乳、尿液等处[7]。有确凿证据表明，外泌体具有与来源细胞相似的功能作用[7]，而组织损伤、缺氧等应激条件，可影响相关细胞外泌体的成分组成及合成、分泌，进而参与损伤修复等病理过程[8]。

血小板是没有基因组DNA的无核细胞，但它含有丰富多样的mRNA和miRNA，是人体循环血浆中外泌体的主要来源[9]，甚至有文献报道，血小板源外泌体数量多达血清外泌体总数的70%，并参与炎症和动脉粥样硬化等多种重要病理生理机制[10]。富血小板血浆来源外泌体(exosomes derived from platelet rich plasma，PRP-exos)是通过过滤、离心等多种方法从PRP中提取获得的血小板源外泌体，其大小、形态及部分蛋白标记物与其他细胞的外泌体相似，同样是细胞间通讯作用的主要媒介，不同的是血小板外泌体内部含有更多的趋化因子、生长因子等活性物质[11]。近年来，已有大量报道证实了PRP在促进骨、软骨等组织中的修复作用[12]，而PRP-exos在其中充当着重要角色，据研究报道，PRP的组织修复活性可能是由于生长因子和其他生物活性分子的有效细胞间通讯作用所致，这些分子通过搭载于PRP-exos来介导[13]。

1 外泌体的生理特性

1.1 靶向性 外泌体本身具有一定的内在靶向性，例如中枢神经细胞来源的外泌体能通过血脑屏障靶向特定的神经[14]，缺氧肿瘤细胞来源的外泌体倾向于向缺氧肿瘤组织内募集[15]，这种特性主要与其膜表面的蛋白相关。当出现缺氧、损伤等刺激时，释放至胞外的外泌体可作用于附近细胞，也可通过体液系统达到应激部位靶细胞，通过膜表面配体-受体蛋白的相互识别与结合，外泌体膜与靶细胞膜融合并向胞浆内释放搭载物，这是最常见的外泌体-靶细胞作用方式[16]。

1.2 稳定性和生物兼容性 除了具有更强的组织修复潜力，PRP-exos在稳定性及生物兼容性等方面还具有明显优势。一方面，外泌体双层脂质膜的包裹作用，可以保护所搭载的生长因子及遗传物质不被体内降解酶及其他化学物质影响，从而更好地发挥修复作用[17]。同时外泌体也存在针对免疫清除的主动识别避免机制，据报道，外泌体膜表面表达的CD47分子能保护外泌体远离单核巨噬细胞系统，从而避免被清除[18]。另一方面，外泌体具有极低的免疫原性，治疗中发生免疫排斥及发热等不良反应可能性更小；这也使得PRP-exos来源更加广泛，不再局限于自体血，可直接利用临床血库的同种异体血，便于进行规模量产及临床治疗；此外，PRP-exos为跨物种的治疗及通讯提供了可能[19]，目前已有不少研究报道过PRP-exos用于跨物种治疗的潜力[20-21]。

2 外泌体的提取与鉴定

在对PRP外泌体的研究中，必须提高外泌体的纯度，排除细胞碎片、杂质蛋白及其他纳米大小胞外结构的影响，从而保证生理特性及功能分析的准确性。PRP-exos的提取包括PRP提取和外泌体提取两部分。PRP的提取方法相对成熟，常用二次离心法，通过预离心去除大部分红细胞、白细胞及其他血浆成分，包括Anitua法、Petrungaro法、Landesberg法、Aghaloo法等[12]。针对PRP外泌体的提取及鉴定方法目前尚无针对性研究报道，可参照其它外泌体的提取及鉴定方法，相关研究中常用的是Thery等[22]的差速超速离心法。Aatonen等[23]研究发现，差速超速离心法提取的血小板外泌体中混有大量胞外体(ectosomes)，这可能是由于二者在直径上存在部分重叠(一般来说，血小板外泌体直径小于100 nm，而胞外体直径为100～1 000 nm)，或者存在较大但较轻的胞外体和较小但密度较高的外泌体，离心步骤难以分离两者。对此，20 000×g的离心步骤可以减少250～500 nm的胞外体数量，增加提取物中100 nm以下小泡的占比，从而提高外泌体的纯度。

2.1 外泌体提取 常用的外泌体提取方法共6种，包括超速离心法、聚合物沉淀法、超滤法、免疫亲和法、尺寸排阻色谱法和微流控技术[24]。这些提取技术存在各自的优缺点，尤其在外泌体的纯度上均存在不足，事实上采用现有技术制备的“外泌体样品”不仅含有脂蛋白、脂质等杂质，还包括大量的非外泌体小泡，如微泡、凋亡小体和胞体碎片[25]。

超速离心法目前应用最广泛，被认为是外泌体提取的金标准[26]，缺点在于设备昂贵，提取耗时。差速超速离心法通过反复的超速离心步骤，分离不同粒径和密度的颗粒，最终获得沉积的外泌体，可用于大量的外泌体提取，但获得的外泌体可能存在脂蛋白和蛋白杂质污染风险[26]；相比而言，蔗糖密度梯度离心法可获得更高纯度的外泌体[27]，但需要严格把控离心时间，对操作技术要求较高[24]。聚合物沉淀法具有高产率的优点，通过这种方法在尿液样本中能提取保留更多的外泌体、miRNAs及mRNAs[28]，常用的聚合物添加剂为分子量6 000～20 000 Da的聚乙二醇[29]，在最近的报道中，水两相体系(aqueous two-phase system，ATPs)通过加入聚乙二醇和右旋糖酐混合而成的添加剂，在普通实验设备条件下15 min就可获得回收率约70%的外泌体，尽管高粘度对后续聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)有不利影响，ATPs法仍提供了一种快速、廉价的外泌体提取方法[30]。尺寸排阻色谱法早在外泌体发现之前就广泛用于脂质颗粒等大分子的分离，近几年在外泌体的提取中应用越来越多，这种方法能最大限度保留外泌体的结构和功能完整性[31]，提取可重复性强，采集简单，不需要额外预处理[32]。iZON公司在此基础开发出自动外泌体分离系统(QEV)，该系统允许快速、精确、可扩展和自动化的外泌体分离[33]。Takov等[34]最近将QEV和超速离心进行比较，发现QEV含有更高的外泌体数、外泌体蛋白和更强的标记信号，但是存在过量的脂蛋白污染物。此外，近几年还陆续报道了具有高效率的基于免疫亲和力的微流控技术[35]、尺寸依赖的微流控技术[36]以及无接触粒子分选机制(如弹性升力、声学和介电泳)的微流控系统[37]。目前，微流控技术正通过将传统的两步程序(外泌体分离和定性)转变为一个完整的一步过程，极大地改变了基于外泌体的诊断前景[38]。

2.2 PRP外泌体鉴定 目前外泌体的鉴定主要依靠形态、大小和蛋白标记几个表征，方法包括：(1)扫描电镜。透射电子显微镜具有较高分辨率，通过形态学观察，外泌体为30～200 nm的杯状或球状膜性结构。(2)纳米粒子追踪分析仪。观察波动的光照强度下样品颗粒的布朗运动，记录运动路径，利用NanoSight等软件，根据斯托克斯-爱因斯坦方程计算浓度和尺寸分布。(3)蛋白标记物鉴定。通常外泌体具有来源细胞的标记物，典型的共性表面蛋白标记物有肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG 101)蛋白、CD 9、CD 63、CD 81、热休克蛋白等，而PRP来源外泌体还拥有血小板标记物CD 41[13]。事实上，所有表征鉴定方法都不能达到100%特异性，甚至像CD 63和CD 81这样的经典外泌体标记物也能在其他亚细胞器官找到[39]，因此需要联合多种表征方法来增加鉴定的准确性。

3 PRP外泌体的组织修复作用及机制

PRP-exos释放至细胞外空间后，可以与靶细胞的质膜结合和融合，或者被靶细胞吞噬，从而改变受体细胞的生物学功能，这种结合作用由膜表面受体-配体蛋白的特异性识别介导[16，40]。PRP-exos的组织修复作用机制可能主要包括两个方面：(1)其包裹富集有大量高浓度生长因子，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)以及血小板内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，成纤细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等[17]。研究发现PRP-exos生长因子远远多于PRP，同体积情况下，其碱性成纤细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，BFGF)和血小板源性生长因子-BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)和TGF-β1的浓度分别是PRP的3.3倍、2.7倍和35.5倍[13]。这些生长因子之间相互协同，共同促进相关细胞的增殖分化及合成代谢，促进胞外基质及血管生成，改善前体细胞的趋化性，从而达到促进损伤组织修复的作用[2]。(2)PRP-exos通过转移蛋白质、mRNAs、miRNAs等活性物质至受体细胞，调节靶细胞的基因表达、蛋白翻译及细胞功能特性来维持胞内稳态及周围病损修复[41-42]。总之，PRP-exos可以减少缺血和坏死微环境中细胞凋亡，促进血管形成，募集间充质干细胞及修复细胞并促进细胞增殖分化，改善相关蛋白的表达，从而促进组织修复。

3.1 骨组织修复作用 过去人们多关注于干细胞来源外泌体的功能及潜在机制的研究，但很少有研究报道血小板衍生外泌体的存在和作用。2014年，Torreggiani等[10]从PRP中分离出外泌体，并首次证明其对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖迁移和成骨分化有潜在的促进作用。这些PRP-exos作用于局部环境的干细胞和骨前体细胞等修复细胞，促进修复细胞向骨损伤处迁移、细胞增殖和成骨细胞分化，从而达到促进骨组织修复的作用。实验还发现，PRP-exos诱导BMSCs增殖分化的作用随浓度增加而增加，而当浓度超过50 μg/mL时，其诱导作用却降低，说明PRP-exos的诱导促进作用可能在一定范围内呈浓度或剂量依赖性。

2017年，Tao等[43]将PRP-exos(50 μg/mL)和氢化可的松单独或联合加入小鼠成骨细胞、人骨髓间充质干细胞和人微血管内皮细胞培养液中，发现PRP-exos可促进B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)等抗凋亡蛋白的表达，逆转激素对三种细胞增殖的抑制作用，促进骨组织的维持再生，同时，PRP-exos还能提高runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx 2)、Ⅰ型胶原和β-连环蛋白(β-catenin)等成骨相关蛋白的表达，维持成骨细胞、骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。其体外实验还显示，血小板内皮生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板源性生长因子BB在PRP-exos中均有高表达，并有利于新血管的形成。将PRP-exos用于经激素诱导的股骨头坏死大鼠模型同样发现了其对股骨头血管的保护及骨密度、骨强度的维持，证明了PRP-exos对糖皮质激素诱导股骨头坏死的预防作用。

3.2 软骨组织修复作用 由于软骨组织缺乏血管，软骨细胞分裂增殖能力有限，关节软骨始终暴露于机械负荷，尤其骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者还存在关节内炎症因子的干扰，关节软骨修复一直是再生医学中的难题。Liu等[44]在近期研究中，报道了PRP-exos对OA模型肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等促炎因子释放的抑制作用，并通过wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖、迁移和抑制软骨细胞凋亡。在经过白细胞介素1β预处理的兔软骨细胞培养液中加入不同浓度的PRP外泌体以及激活后的PRP，发现PRP-exos(50 μg/mL)及PRP(50 μg/mL)可显著降低TNF-α水平，其中PRP-exos(50 μg/mL)作用最强，其次为PRP(50 μg/mL)，差异不显著；PRP-exos(5 μg/mL)的抑制作用优于PRP(5 μg/mL)。该研究还发现PRP-exos可通过wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖和迁移，并抑制软骨细胞凋亡，而高浓度(50 μg/mL)的PRP-exos有更明显的效果。

Liu等[44]还报道了PRP外泌体对OA的预防作用。研究将24只白兔随机分为4组。对照组(非手术组)，每周注射一次生理盐水，每周一次；OA模型组(手术组)，每周一次关节内注射生理盐水；OA+PRP-exos组(手术组)，每周1次关节内注射100 μg/mL PRP-exos；OA+PRP组(手术组)，每周1次关节内注射100 μg/mL PRP。用10%水合氯醛(4 mL/kg)注射致OA模型兔，行左膝手术，切断内侧副韧带和前交叉韧带，切除内侧半月板；6周后评估软骨退化情况。结果显示OA组关节软骨表面有局灶性增生，软骨细胞排列不规则，边界模糊。但骨关节炎组的异常现象可被PRP-exos和PRP逆转。前者的优势明显大于后者。此外，PRP-Exos可逆转骨关节炎引起的Ⅱ型胶原蛋白表达的下降和Wnt5a蛋白的上调。Ⅱ型胶原蛋白是透明软骨基质的主要纤维成分，而Wnt5a蛋白能诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的增加，抑制Ⅱ型胶原的表达[45]，因此，PRP-exos对于关节软骨的基质合成是有利的。

由此可得出结论，PRP-exos不仅可减少OA模型中促炎症因子TNF-α的释放，减轻炎症反应，还可减少软骨组织丢失，促进软骨的再生修复，逆转OA损伤。并且PRP-exos的效应与浓度相关，较高浓度的PRP外泌体具有更高的修复效应，而较低浓度的PRP-exos(5 μg/mL)修复效应差于高浓度PRP(50 μg/mL)，甚至与同等浓度的PRP相比优势并不显著；这也从侧面说明要充分发挥PRP-exos的修复作用可能需要一个适当的浓度或剂量，浓度过高或过低都可能修影响修复效果；毋庸置疑的是，PRP-exos为OA及软骨损伤提供了一种新的治疗途径。

3.3 慢性创面修复作用 在慢性创面修复愈合过程中，血管内皮细胞增殖、血管再生是关键因素之一。文献表明，血小板衍生生长因子或外泌体中的mRNA及miRNA与血管再生有着密切关系[46]。Guo等[47]将不同浓度PRP-exos和PRP分别加入成纤维细胞、人微血管内皮细胞培养液中，发现二者均能促进细胞的增殖和迁移，其中PRP-exos组效果最显著，在培养第3天、第5天时PRP-exos(50 μg/mL)对成纤维细胞增殖的促进作用较PRP-exos(5 μg/mL)并无明显差异，但在第7天时前者细胞增值率显著优于后者，说明PRP-exos具有更强的成纤维、成血管能力，同时修复效应的持续时间更长，这种持久的修复效应可能与外泌体miRNA的细胞间通讯或干细胞诱导分化有关；而对微血管内皮细胞增殖的促进作用，PRP-exos(50 μg/mL)在第3、5、7天均较为显著，与PRP-exos共同培养6 h后，微血管内皮细胞形成了相对较长、较致密的血管样结构网络。将PRP-exos海藻酸钠水凝胶用于糖尿病大鼠的慢性创面治疗，结果显示，经PRP-exos处理的创面内血管面积和血管数目均显著高于PRP组和对照组，其创面面积收缩效果在第3、7、14天等节点均最为显著。

Xu等[48]将负载PRP-exos的壳聚糖/丝质凝胶海绵用于糖尿病小鼠皮肤创面的治疗研究中也证实，PRP-exos单独或联合莪术多糖明显加速了糖尿病大鼠的创面胶原蛋白合成和沉积、再上皮化以及皮肤血管生成，有助于伤口缩小，从而加快了糖尿病创面的愈合速度。

这些结果表明，PRP-exos不仅能促进成纤维细胞、内皮细胞的增殖和迁移，促进创面胶原蛋白合成，还有助于新血管的形成和皮肤再上皮化，在皮肤创面愈合中有明显的促进作用。

4 小结与展望

PRP-exos拥有高浓度的生长因子、活性蛋白及多种RNAs等搭载物，在PRP的组织修复中担任重要角色，同时也在细胞间通讯及介导生物功能上发挥重要作用，它不仅具有成骨、成软骨、血管生成及创面修复等巨大的组织修复潜力，还拥有较高的稳定性及生物兼容性，易于规模量产并投入治疗等诸多优势，已被证实可逆转糖皮质激素所致的股骨头坏死，有益于慢性创面的愈合，还可减轻OA模型炎症反应并促进软骨再生，阻止骨关节炎的发生进展。

PRP-exos用于修复治疗的方式是多样性的，可直接静脉注射，或以液态、凝胶状态注射于缺损部位，也可联合组织工程支架材料与缺损部位相契合[47-48]，而在联合干细胞或联合手术应用方面也值得探索。虽然其组织修复的分子机制尚不完全清楚，但随着研究的深入，PRP-exos有望被更多人肯定和接受，甚至替代PRP成为骨、软骨组织及创面愈合等再生修复治疗的新途径。

然而，关于PRP-exos也存在诸多问题需要解决，在彻底探索PRP-exos的生理特性及功能分析前，提取外泌体仍需要一种更加高效、快捷的优化方案。根据目前的研究报道，PRP-exos的组织修复作用虽效果明显，但相关文献的数量较少，需要更多报道进一步证实。另外，PRP-exos搭载的各种RNA片段在发挥细胞间通讯的同时，可能会导致靶细胞的基因突变。据报道，外泌体还与肿瘤发生、肿瘤细胞存活、化疗耐药和早期转移有关[49]。尽管PRP-exos已多次用于动物实验，且并未报道出现不良后果，但PRP-exos的生物安全性仍需长期、大量的研究来证实。