鸢尾素通过激活自噬促进老龄小鼠BMSCs骨向分化的体外研究

孙磊 董科明 翟羽 赵刚 刘翠 刘彦

随着全球人口老龄化的快速进展，老年性骨质疏松患者呈现爆发式地增长［1］。骨质疏松症是种植修复的相对禁忌，骨质疏松患者进行种植的成功率远低于普通人群。因此，防治骨质疏松症对于提高种植修复的成功率具有重要的临床意义［2］。目前治疗骨质疏松的药物，如选择性雌激素受体调节剂、降钙素和双膦酸盐类等，因其诸多的毒副作用限制了其广泛的临床应用［3］。所以，人们迫切需要找到一种毒副作用小、安全性高的骨质疏松症治疗药物。鸢尾素是近年来发现的一种由运动诱导产生的肌源性细胞因子，它在棕色脂肪组织中表达较高［4］。最近有文献报道，老年人血液中鸢尾素的浓度与其骨密度呈正相关［5］。而且，有动物实验发现，鸢尾素能缓解老龄性骨质疏松，提高其骨密度并改善骨结构［6］。但是，鸢尾素对骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）骨向分化的影响及其作用机制尚不清楚。因此，本研究拟以体外培养的老龄小鼠BMSCs为研究对象，观察鸢尾素对BMSCs骨向分化的影响并深入探讨其作用机制。

1.材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器18个月龄雄性清洁级C57BL/6J小鼠，购自HFK Bioscience。Irisin（美国Phoenix Pharmaceuticals）；α-MEM培养基、高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松、L-谷氨酰胺、二甲基亚砜（美国Sigma公司）；青霉素、链霉素（中国国药集团)；3-甲基腺嘌呤（3-MA;美国TargetMol公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（上海碧云天生物）；P62抗体（货号：#5114;稀释比例:1∶1000;Cell Signaling Technologies,美国）；LC3B抗体（货号：Ab192890;稀释比例:1∶2000;Abcam,英国）；BCA测定试剂盒（南京建成）；PVDF膜（美国Millipore公司）。

Herocell C1型CO2恒温培养箱（上海润度生物）；BCM-1000A型生物净化工作台（苏州安泰空气技术公司）；5702R型低速离心机、Biophotometer核酸蛋白测定仪（德国艾本德公司）；Multiskan型酶联仪（美国赛默飞·世尔公司）；DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪（北京六一仪器厂）；LW300LFT型正置荧光显微镜（北京测维光电仪器厂）。

1.2 全骨髓贴壁法分离培养BMSCs在无菌环境中钝性分离老龄小鼠双侧胫骨表面附着的软组织，然后将胫骨浸入PBS缓冲液中，剪除干骺端后暴露髓腔。使用PBS缓冲液反复冲洗髓腔，将冲出的骨髓液以400g×5min离心后弃上清液；再用5ml含10%胎牛血清α-MEM培养液重悬细胞沉淀，接入25cm2培养瓶中培养（培养条件：5%CO2，95%O2，100%饱和湿度），5天后全换液。待细胞铺满80%的瓶底面积时进行传代扩增培养。

1.3 ALP活性定量检测将第3代BMSCs以5.0×103/孔的细胞密度接种于96孔板，待细胞铺满75%的瓶底面积时，换为自行配制的成骨诱导液（在高糖DMEM培养基中加入100ml/L胎牛血清、100nmol/L地塞米松、10nmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L左旋维生素C）培养，同时加入0、10、50、100、200ng/mL的鸢尾素，分别于诱导培养后的第1、3、5、7天检测520nm处测量OD值。

1.4 Western blot检测自噬相关蛋白的表达 将第3代细胞以6.0×106/孔的密度接种于24孔板，待细胞铺满75%的瓶底面积时，加入成骨诱导液培养24h。然后，将细胞分为3组：对照组、鸢尾素组、鸢尾素+3-MA（自噬抑制）组。先加3-MA（2.5mmol/L）预处理30min，然后加入鸢尾素。加药后继续诱导培养3天后取各组细胞，PBS缓冲液冲洗2遍后，加入细胞裂解液裂解细胞，并提取总蛋白。测定总蛋白浓度后，各样本取50μg总蛋白，上样于PAGE胶后电泳。电泳后220mA,2h转膜于0.2μm的PVDF膜上，室温封闭2h，分别滴加特异性一抗封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗封闭2h，最后用化学发光剂染色、显影。采用Image J软件分析胶片灰度值。

1.5 qPCR检测成骨相关基因的转录表达 各组细胞成骨诱导培养3天后提取细胞的总RNA，再将RNA反转录为cDNA并进行扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，96℃变30s，58℃退火30s，73℃延伸45s，扩增30个循环，最后73℃延伸10min。检测成骨相关转录因子（Runx2）、锌指结构转录因子（Osx）、ALP、Ⅰ型胶原（COL-I）、护骨素（OPG）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN）等成骨相关基因的转录表达。基因引物序列参照以往文献报道［7］。

1.6 ALP染色 各组细胞成骨诱导培养1周后，进行染色并拍照。具体步骤如下：①弃培养液。使用PBS缓冲液将细胞漂洗3遍后，采用细胞固定液固定30s；②加入染色液室温下避光染色15min，自来水冲洗；③中性红溶液复染2min，自来水冲洗干净后拍照。

1.7 统计学分析 采用IBM SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。除特殊标注外，所有数据均以均数±标准差表示，所有实验至少重复3次。对计量资料采用单因素方差分析进行统计比较，如果方差齐，则采用LSD法进行进一步比较;如果方差不齐，则采用Tamhane′s T2法进行进一步比较。方差齐性检验采用Levene′s检验，检验水准α=0.1。实验结果的统计分析以α=0.05为检验水准，如果P＜0.05（双侧）则认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 老龄小鼠BMSCs形态观察 老龄小鼠BMSCs原代培养3天时便有少量细胞贴壁，细胞形态不规则。1周后贴壁生长细胞数明显增多，有呈集落样生长的趋势。约10天时，细胞可铺满80%的瓶底面积，开始按1∶2比例进行传代。传代后细胞增殖加快，4-6天即可长满瓶底面积的80%（图1）。

2.2 ALP活性定量 为了获取鸢尾素对老龄小鼠BMSCs骨向分化影响的最适干预浓度，首先进行了剂量-反应实验。实验结果表明，鸢尾素可呈浓度依赖性地增加老龄鼠BMSCs的ALP活性，而且100ng/mL鸢尾素与200ng/mL鸢尾素增加ALP活性的作用差异无统计学意义（表2）。因此，本研究选择100ng/mL作为后续实验的干预浓度。

表2 Irisin对老龄小鼠BMSCs的ALP活性影响

2.3 鸢尾素对老龄小鼠BMSCs骨向分化时自噬相关蛋白表达的影响Western blot结果显示：在老龄小鼠BMSCs骨向分化的过程中，鸢尾素显著降低P62蛋白的表达，同时明显升高LC3BII的表达，这提示鸢尾素能够激活老龄鼠BMSCs的自噬活性。当加入特异性自噬抑制剂3-MA后，鸢尾素激活老龄小鼠BMSCs自噬的作用明显减弱（图2）。

图2 Irisin对老龄鼠BMSCs自噬相关蛋白P62和LC3B表达的影响Vehicle,对照组。Irisin,鸢尾素组。Irisin+3-MA，自噬抑制组。LC3BII,14 kDa。*表示与Vehicle组比较P＜0.05，#表示与Irisin组比较P＜0.05。

2.4 鸢尾素对老龄小鼠BMSCs骨向分化时成骨基因表达水平的影响 如图3所示：在BMSCs成骨分化的过程中，与对照组比较，鸢尾素能显著促进成骨相关基因Runx2、Osx、ALP和COL-I的转录表达（P＜0.05）;并且当自噬被抑制后，鸢尾素提高Runx2、Osx、ALP和COL-I表达水平的作用减弱、消失。

图3 BMSCs成骨相关基因转录水平Vehicle,对照组。Irisin,鸢尾素组。Irisin+3-MA，自噬抑制组。*表示与Vehicle组比较P＜0.05，#表示与Irisin组比较P＜0.05。

2.5 ALP染色 对各组BMSCs成骨诱导7天后行ALP染色，结果如图4所示：与对照组相比，鸢尾素组可见广泛交织的蓝染区域;当加入3-MA特异性地抑制自噬后，鸢尾素促进ALP蛋白表达的作用明显减弱。

图4 ALP染色Vehicle,对照组。Irisin,鸢尾素组。Irisin+3-MA，自噬抑制组。图中红色箭头示染色阳性的细胞，标尺=100μm。

3.讨论

本研究以老龄小鼠BMSCs为细胞模型，发现在成骨分化的过程中，鸢尾素既能提高BMSCs的ALP活性，又能上调成骨相关基因，并且证明鸢尾素促进BMSCs骨向分化与激活自噬活性有关。

自噬是一种在进化上高度保守的、真核细胞所特有的程序化降解途径，主要负责细胞内某些长寿蛋白和受损细胞器的降解［8］。自噬是普遍存在于各种真核生物生命过程中用以清除多余的或受损的生物大分子的重要机制，生物体借此维持细胞内的代谢平衡及内环境稳态，这一过程在清除细胞内废物、组织重构和生长发育中都起着极为重要的作用［9，10］。在机体衰老的进程中，自噬活性下调［11］。近期有文献发现，自噬也是维持干细胞的干性和分化能力所必需的［12］。在骨衰老的过程中，自噬调控BMSCs的特征和衰老［12］。而且，自噬可以帮助干细胞抵抗氧化应激引起的损伤［13］。因此，本研究推测鸢尾素促进BMSCs骨向分化可能与重新激活自噬有关。本实验结果表明，鸢尾素显著降低P62的蛋白表达水平，同时提高LC3B-II的蛋白表达水平。P62蛋白连同其结合的多泛素化蛋白一同融合到自噬体中，当自噬体与溶酶体形成自噬溶酶体后，这些蛋白均在自噬溶酶体中降解。所以，P62蛋白可被看作是自噬的一种底物。LC3B存在两种可转化的形式：LC3B-I和LC3B-II。细胞中新合成的LC3B以可溶的形式存在于细胞质中，称为LC3B-I。自噬激活时，LC3B-I可被泛素化修饰并与自噬体的膜融合，此时，以膜结合形式存在的LC3B称为LC3B-II。LC3B-II存在于前自噬体和自噬体中，其数量与自噬体膜的数量呈正相关。所以，细胞中LC3B-II的数量在某种程度上可间接反应细胞的自噬状态［14］。综上所述，本实验结果显示，在骨向分化的过程中，鸢尾素可提高老龄小鼠BMSCs的自噬活性。

为了反证自噬在鸢尾素促进BMSCs骨向分化中的作用，本实验采用自噬特异性抑制剂3-MA抑制自噬。结果表明，当自噬被抑制后，鸢尾素上调BMSCs成骨相关转录因子的作用显著减弱。Runx2和Osx是成骨细胞特异性表达的重要转录因子［15，16］，Runx2和Osx的转录表达启动后能促进下游成骨相关蛋白ALP、COL-Ⅰ、OPG、OPN和OCN等表达。ALP和COL-I是成骨早期的标志蛋白，而OPG、OPN和OCN则是晚期矿化的标志物［17］。本实验结果发现，在骨向分化过程中，鸢尾素能显著上调老龄鼠BMSCs中Runx2、Osx、ALP和COL-I的转录表达。并且在抑制自噬后，鸢尾素的促进成骨转录因子上调的作用显著减弱。在ALP染色实验中，再次验证了抑制自噬后，鸢尾素的促进ALP表达的作用显著减弱。这些实验结果某种程度上证明了鸢尾素促进老龄鼠BMSCs成骨分化至少部分是通过激活自噬实现的。同时，本研究还发现，鸢尾素对OPG、OPN和OCN的转录表达无显著影响。这可能是因为：本实验进行qPCR的时间是在成骨诱导后第3天，此时正处于BMSCs成骨分化早期阶段，晚期成骨分化标志蛋白OPG、OPN和OCN的转录表达还不明显［7］。

综上所述，本研究发现鸢尾素能够在体外促进老龄鼠BMSCs骨向分化，并且鸢尾素的这种作用与激活自噬有关。应用鸢尾素可能是临床上改善老年性骨质疏松患者种植区骨量不足的一种潜在的治疗手段。