钙结合蛋白S100A4调节小鼠骨髓源肥大细胞活化的作用*

吴通前，金筱茜，马岚，周萍萍，李静，袁锐，余芳***

(1.贵州医科大学附属医院 临床研究中心，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 医学检验学院 临床微生物及免疫学教研室，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学附属医院 临床检验中心，贵州 贵阳 550004； 4.湖北医科大学附属东风医院 临床检验中心，湖北 十堰 442008； 5.长沙市第八医院 临床检验中心，湖南 长沙 410100)

长期以来，肥大细胞因具有分泌多种过敏性介质的能力一直被认为是过敏性疾病的关键效应细胞，其激活和募集是过敏性疾病发作和发展的重要效应器[1-4]。肥大细胞的异常积累和激活可促进炎性进展[5]，主要是通过多种途径激活其表面受体并释放多种化学介质及炎性因子[5-6]，从而诱导和维持免疫炎症反应[7-8]。S100A4蛋白属于钙结合蛋白S100家族成员，多表达于肿瘤细胞及免疫细胞，存在于细胞核和胞质内，同时也可分泌至胞外发挥功能[9-11]；并可在蛋白磷酸化、细胞生长存活、细胞迁移分化、促进细胞外基质的降解及重塑等方面起到重要的调控作用，如在慢性炎症疾病中涉及免疫调节与信号通路调节功能[12-15]。已有研究显示，S100A4蛋白亦参与调节过敏性皮炎、过敏性鼻炎及过敏性哮喘的发生与发展[16-17]，但其对肥大细胞的作用尚不明确。因此，本研究通过体外培养野生型(wild type,WT)及S100A4基因敲除(S100A4-/-)小鼠骨髓源肥大细胞(bone marrow-derived mast cells,BMMC)，探究S100A4与肥大细胞活化的相关性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 8～10周龄WT和S100A4基因敲除(S100A4-/-)C57BL/6健康雄性小鼠各2只，来自中国科学院生物物理所秦志海教授团队，均在无特定病原体(specific pathogen free，SPF)实验室饲养，动物实验方案获得本校实验动物伦理委员会批准(批准号1503057)。

1.1.2主要试剂及仪器 RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗及磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自美国Gibco公司，甲苯胺蓝、β-氨基己糖苷酶(β-hexosainidase,β-hex)检测底物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、2-巯基乙醇及离子霉素(ionomycin，ION)购自美国Sigma公司，蛋白运输抑制剂布雷非德菌素A、流式检测抗体白细胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞分化簇117(cluster of differentiation 117，CD117)及Fcε受体I(Fc epsilon receptor I，FcεRI)购自美国BD公司；SYNERGY多功能酶标仪购自美国Therom fisher scientific公司，NAVIOS流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1BMMC培养 取WT和S100A4-/-C57BL/6健康雄性小鼠各2只，无菌条件下分别取2种小鼠胫骨与股骨提取骨髓，反复吹打至骨髓成细胞悬液，300目过滤网过滤1次，PBS洗2次；用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、1%双抗、4 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L 2-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠溶液、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液及2 500 μg/L IL-3)重悬细胞，置于37 ℃的5%CO2培养箱中培养WT BMMC以及S100A4-/-BMMC[18]。

1.2.2BMMC鉴定及S100A4表达检测 取培养第1、2及3周的BMMC，采用甲苯胺蓝染色鉴定肥大细胞，分别使用抗小鼠CD117 PE、抗小鼠FcεRI Pacific blue和抗小鼠S100A4 FITC染色，流式细胞术检测BMMC纯度及检测BMMC的S100A4表达，其中CD117 PE与FcεRI Pacific blue双阳性细胞(散点图第四象限)代表成熟BMMC[19]。

1.2.3S100A4蛋白诱导WT BMMC活化检测 取1.5×109个/L成熟WT BMMC铺于96孔板，分为S100A4蛋白处理组(S100A4蛋白1 500 μg/L)和PBS对照组(S100A4白蛋等量体积PBS)，各组3个重复，37 ℃的5%CO2培养箱中孵育30 min，4 ℃离心机1 000 r/min离心5 min，分别取各孔培养上清50 μL加至新的96孔板，再分别加入β-hex底物50 μL混匀，37 ℃恒温摇床孵育1.5 h，酶标仪检测410 nm处吸光度(optical density,OD)；按上述分组及处理，向各组同时加入蛋白运输抑制剂布雷非德菌素A 1 μL，37 ℃的5%CO2培养箱中孵育3 h，离心机1 000 r/min 4 ℃离心5 min，去上清，加抗小鼠IL-5 APC、抗小鼠IL6-V450、抗小鼠IL-13 PE及抗小鼠TNF-α FTIC进行染色，流式细胞术上机检测PBS对照组及S100A4蛋白处理组中成熟BMMC的IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α荧光强度并计算相对荧光指数(relative fluorescence index,rFI)[20]。

1.2.4离子霉素(ION)诱导WT和S100A4-/-BMMC活化检测 取1.5×109个/L小鼠成熟WT BMMC铺于96孔板，分为WT PBS对照组与WT ION处理组；同时取1.5×109个/L小鼠成熟S100A4-/-BMMC铺于96孔板，分为S100A4-/-PBS对照组与S100A4-/-ION处理组。各组3个重复，INO 1 500 μg/L分别加至WT ION处理组与S100A4-/-ION处理组，以ION等量体积PBS加入至WT PBS对照组及S100A4-/-PBS对照组，经ION处理30 min后，各组培养上清用于检测β-hexOD；经ION处理3 h，流式细胞术上机检测前述各组小鼠成熟BMMC中IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α荧光强度并计算rFI。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BMMC培养鉴定及S100A4表达检测

流式鉴定结果显示，第1周时小鼠BMMC纯度为10%左右，第2周为40%左右，第3周基本成熟，纯度达到80%以上(图1A)；甲苯胺蓝染色结果显示，图中蓝紫色细胞为小鼠成熟BMMC，第1周较少，第2周明显增多，第3周BMMC基本成熟(图1B)；S100A4的检测结果显示，WT BMMC表达S100A4，S100A4-/-BMMC不表达S100A4(图1C)。

注：A为成熟WT、S100A4-/-BMMC培养的鉴定结果；B为BMMC甲苯胺蓝染色(400×)；C为S100A4在BMMC上的表达。图1 小鼠成熟BMMC培养鉴定及S100A4表达Fig.1 Identification and S100A4 expression of mature BMMC

2.2 S100A4蛋白诱导小鼠成熟WT BMMC活化检测

S100A4蛋白处理组小鼠成熟BMMC培养上清β-hex含量高于PBS对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图2A)；S100A4蛋白处理组小鼠成熟BMMC胞内相关炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表达水平也均高于PBS对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，图2B)。

注：A为β-hex检测OD值；B为炎性因子rFI水平；(1)与PBS对照组比较，P<0.05。图2 S100A4蛋白诱导小鼠成熟WT BMMC活化检测Fig.2 Detection of mature WT BMMC activation induced by S100A4 protein

2.3 ION诱导小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化检测

WT ION处理组小鼠β-hex水平分别高于WT PBS对照组和S100A4-/-ION处理组(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION处理组则高于S100A4-/-PBS对照组(P<0.05，图3A)；WT ION处理组小鼠细胞内炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表达水平分别高于WT PBS对照组和S100A4-/-ION处理组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION处理组小鼠IL-5和IL-6高于S100A4-/-PBS对照组差异有统计学意义(P<0.05，图3B)。

注：A为β-hex检测的OD值；B为炎性因子rFI直条图；(1)与WT PBS对组比较，P<0.01；(2)与S100A4-/-PBS组比较，P<0.05；(3)与WT ION组比较，P<0.05。图3 ION诱导小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化检测Fig.3 Detection of mature WT and S100A4-/-BMMC activation induced by ION

3 讨论

S1000A4具有调节血管生成、细胞生存、运动及侵袭等生物学功能，也参与慢性炎症疾病的免疫调节以及信号通路调节[21]。有研究显示，在过敏性鼻炎患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培养上清中，通过S100A4抗体处理后IL-5和IL-13降低，证实了其与过敏性疾病的相关性[18]，但作用机制尚不明确，对于过敏性疾病的重要效应细胞肥大细胞的作用研究尚有待开发。因此探讨S100A4与肥大细胞作用的相关性在过敏性疾病的发生与发展领域具有潜在的意义。本研究通过WT、S100A4-/-小鼠培养成熟BMMC，BMMC第3周时已基本成熟，纯度达到80%以上，为后续实验提供了实验基础，同时成熟BMMC中存在S100A4蛋白的表达。肥大细胞活化是过敏性疾病产生临床症状的重要过程，其活化产生多种炎性介质及炎性因子[22]。通过S100A4蛋白直接作用于成熟WT BMMC后，S100A4蛋白处理组β-hex水平高于PBS对照组(P<0.05)，同时，S100A4蛋白处理组中胞内炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α产生也高于PBS对照组(P<0.05)，提示外源性S100A4蛋白可直接诱导BMMC激活。但其作用机制尚不明确。有研究表明，S100A4在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)单核细胞中能够通过Toll样受体4(toll-like receptors，TLR4)介导炎性应答，促进炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的释放，相关肿瘤研究也发现S100A4蛋白通过TLR-4信号通路传递功能调节信号[23-24]。因此，有理由推测在肥大细胞的活化中，S100A4可能通过TLR-4这一受体传递激活信号，但还需进一步研究来明确。

近期研究表明，通过S100A4抗体封闭过敏性哮喘模型小鼠体内S100A4蛋白的功能发挥后，相对于S100A4未封闭组，小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-5、IL-13等炎性因子水平以及气道炎症明显受到抑制，提示通过抑制S100A4蛋白表达可能抑制过敏性疾病的发生与发展，其机制可能是抑制了肥大细胞或嗜酸性粒细胞的活化，进而抑制炎性的产生[17]，但没有充分的证据证实这一观点。基与此观点，本实验使用ION处理成熟WT及S100A4-/-BMMC诱导其活化，结果显示β-hex水平明显低于WT-ION处理组(P<0.05)，S100A4-/-ION处理组胞内相关炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平也低于WT-ION处理组(P<0.05)，这一结果提示S100A4基因的缺失抑制BMMC的活化。这或许是一个证实S100A4在体内参与过敏性疾病调节的潜在研究方向，但还需进一步在体内进行证实。

综上所述，本研究通过体外细胞学实验表明S100A4蛋白能够直接诱导肥大细胞活化及炎性炎性因子的产生，S100A4基因的缺失抑制肥大细胞活化及其炎性因子的产生，为后续其参与过敏性疾病中的作用机制研究提供了前期研究基础。