过表达miR-203对脓毒症急性肾损伤大鼠的保护作用

李启成，虞大为，宗静，朱江磊，徐东升，王忠祥，王诗波

解放军联勤保障部队第904医院 a.急诊科；b.消化内科；江苏 无锡 214100

脓毒症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征，可累及多个系统和器官，进而导致患者死亡[1]。其中，脓毒症引起的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是严重的并发症之一，病死率高[2-3]。研究表明，AKI的早期发现及治疗可减少患者的死亡[4]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是长度约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA[5]，研究证实其影响人体内关键代谢途径[6]、病理进程[7]，进而在细胞增殖、分化、凋亡及应激反应[8]等方面发挥重要作用。miR-203在不同的器官组织、肿瘤中具有差异性表达，例如膀胱癌[9]、胃癌[10]、大肠癌[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]等，但目前鲜有报道miR-203的异常表达与脓毒症大鼠急性肾损伤间的关系。本研究将探讨miR-203对脓毒症大鼠急性肾损伤的保护作用，以期为临床早期干预脓毒症急性肾损伤提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康的SPF级雄性成年SD大鼠购自河南省实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK（豫）2014-0002]，体重200±50 g，于SPF级实验室用无菌水和饲料饲养1周后进行造模处理。

Keygen Trans新型转染试剂购自江苏凯基生物技术股份有限公司；miRNA qRT-PCR检测试剂盒、cDNA合成试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；改良HE染色试剂盒、高效RIPA裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；miR-203 agomir、agomir-NC由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成；大鼠肌酐（Cr）ELISA定量检测试剂盒、大鼠尿素氮（BUN）ELISA试剂盒、大鼠肾损伤分子1（KIM-1）ELISA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）ELISA试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；大鼠白介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒购自安徽经科生物技术有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；β-actin抗体（ab6276，小鼠单克隆抗体）、Toll样受体4（TLR4）抗体（兔多克隆抗体）、磷酸化p65（p-p65）抗体（兔多克隆抗体）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）购自艾博抗（上海）贸易有限公司；磷酸化NF-κB（p-IκBα）抗体（小鼠单克隆抗体）购自美国圣克鲁斯生物技术公司。

1.2 实验分组及建模

将40只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、miR-203 agomir组、agomir-NC组，每组10只，通过盲肠结扎穿刺法（CLP）建立脓毒症大鼠模型。miR-203agomir、agomir-NC组模型建立后分别尾静脉注射miR-203 agomir和agomir-NC，每次10 nmol/L，模型组和假手术组注射等量的生理盐水，24 h后检测相关指标变化情况。

1.3 RT-qPCR检测miR-203表达水平

提取大鼠肾组织总RNA，反转录为cDNA，RT-qPCR测定miR-203表达水平，U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算其相对表达。miR-203正向引物为5′-ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTA-3′，反向引物为 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6 正向引物为 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件：95℃预变性 15 min，然后按 95℃ 5 s、60℃ 30 s进行35个循环扩增。

1.4 ELISA检测血清肾功能指标、肾损伤指标、炎性指标

收集全血标本，4℃、1000 r/min离心20 min，收集上清。将ELISA检测试剂盒于室温条件下平衡20 min，标准孔中加入不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL；每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃孵育60 min；弃上清，加入350 μL洗涤液，室温孵育1 min；弃上清，上述步骤重复5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL终止液，用酶标仪测定各孔的D450nm值。

1.5 HE染色观察各组大鼠肾组织病理变化

SD大鼠造模成功24 h后麻醉处死。取肾组织，4%多聚甲醛固定后进行梯度无水乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，用苏木精-伊红溶液染色，脱水，中性树脂封片。光学显微镜观察大鼠肾组织的病理变化。

1.6 Western印迹检测蛋白表达水平

组织匀浆后用RIPA裂解液提取各标本的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE。转PVDF膜后加入5%脱脂牛奶进行封闭，然后加入一抗（1∶1000），4℃过夜孵育；加入二抗（1∶3000），室温孵育1 h；洗膜后用ECL发光液显影，采用Image J软件对条带进行灰度分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0医学统计学软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组数据之间比较采用F检验，组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠miR-203表达水平

与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠肾组织miR-203表达水平显著下降（P＜0.05）；与agomir-NC组比，miR-203 agomir组大鼠肾组织miR-203表达水平显著升高（P＜0.05），提示转染成功（图1）。

2.2 各组大鼠血清中肾功能及肾损伤标志物含量

与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均显著升高（F值依次为36.249、124.320、38.819、260.307，P＜0.05）；与agomir-NC组比，miR-203 agomir组大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均显著下降（t值依次为5.650、8.559、7.498、16.797，P＜0.05）（图2）。

2.3 各组大鼠血清炎性因子含量

与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均显著升高（F值分别为248.561、91.946，P＜0.05）；与agomir-NC组比，miR-203 agomir组大鼠TNF-α、IL-1β含量均显著下降（t值分别为16.926、7.516，P＜0.05）（图3）。

2.4 各组大鼠肾组织病理变化

假手术组大鼠肾组织结构正常；模型组和agomir组大鼠肾组织细胞水肿，伴有炎性浸润、肾小球皱缩、肾小管闭塞；miR-203 agomir组大鼠肾组织水肿、炎性浸润以及肾小球和肾小管病变情况均得到缓解（图4）。

2.5 miR-203对TLR4/NF-κB信号通路的影响

与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠肾组织 TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表达水平显著升 高（P＜0.05）；与 agomir-NC 组 比 ，miR-203 agomir组大鼠肾组织TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）（图5）。

图1 各组大鼠miR-203表达水平

图2 各组大鼠血清中肾功能及肾损伤标志物含量

3 讨论

图3 各组大鼠血清炎性因子含量

30%～50%脓毒症患者会发生脓毒症急性肾损伤，这是常见的并发症之一，具有病情危重、临床治疗不佳、致死率高等特征[14]。已有研究表明，异常表达的miR-203在多种类型的癌症中扮演着抑癌的角色。Shen等[9]发现miR-203可能通过负调控组织转录因子Twist同系物1（Twist1）而在膀胱癌细胞中充当肿瘤抑制性miRNA。Du等[11]研究表明miR-203通过靶向重组人帕金森病蛋白7（DJ-1，PARK7）抑制大肠癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。Chen等[15]发现miR-203通过靶向脂肪酸结合蛋白4（FABP4）抑制肺癌细胞转移。本研究通过RT-qPCR检测各组大鼠肾组织miR-203表达水平，发现与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠肾组织miR-203表达水平显著下降；与agomir-NC组比，miR-203 agomir组大鼠肾组织miR-203表达水平显著升高。这提示miR-203在脓毒症急性肾损伤发生发展中扮演着抑癌作用。

HE染色结果显示，与假手术组比，模型组和agomir-NC组大鼠肾组织细胞水肿，且伴有炎性浸润、肾小球皱缩；过表达miR-203后，肾组织水肿、炎性浸润及肾小球皱缩均得到显著改善。Cr和BUN是判断肾功能损害的重要指标，在急性肾损伤中高表达[16]；KIM-1和NGAL是急性肾损伤的重要生物标志物，在急性肾损伤早期高表达[17]。Han等[18]研究表明虎杖和肉桂通过降低Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平并抑制肝黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）表达进而改善高尿酸血症大鼠生物肾脏功能。通过ELISA实验观察各组大鼠肾功能指标Cr与BUN的变化，结果显示，与假手术组比，模型组和agomir-NC组血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均显著升高；过表达miR-203后，血清 Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均显著下降。这提示miR-203能够降低脓毒症急性肾损伤的肾功能损害程度。

图4 各组大鼠肾组织病理变化（200×）

图5 miR-203对TLR4/NF-κB信号通路的影响

IL-1β和TNF-α是脓毒症级联反应中单核巨噬细胞产生的重要炎性因子，是反映机体炎症程度的指标[19]。本研究结果显示，与假手术组比，血清IL-1β、TNF-α水平均显著升高；过表达miR-203后，血清IL-1β、TNF-α水平均显著下降。这提示miR-203可能通过抑制炎症反应而发挥肾脏保护作用。

王彬等[20]研究表明，在实验性重度急性胰腺炎组织中的TLR4、NF-κB p65表达变化与肾损伤严重程度和促炎因子的变化一致。Zhang等[21]研究表明Tec激酶的负调控通过TLR4/NF-κB信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肾脏损伤。Zhang等[22]发现棕榈酸通过激活 TLR4/Krüppel样转录因子（KLF7）/NF-κB炎性信号促进炎性细胞因子IL-6的表达。Li等[23]研究表明红景天苷通过抑制TLR4/NF-κB和MAPK信号通路，并减少炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，进而改善肾间质纤维化。李登等[24]研究表明miR-203通过下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。本研究结果显示，与假手术组比，模型组和agomir-NC组肾组织TLR4、p-p65、p-IκBα水平均显著升高；过表达miR-203后，肾组织 TLR4、p-p65、p-IκBα水平均显著下降。这提示miR-203对脓毒症急性肾损伤的保护作用是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路起作用的。

综上所述，本研究表明miR-203在脓毒症急性肾损伤的发生及发展中发挥一定的作用，miR-203在其中呈低表达水平，miR-203能够抑制炎症反应，对脓毒症急性肾损伤大鼠起到保护作用，其机制可能与miR-203抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。miR-203可作为脓毒症急性肾损伤中的预测性生物标志物，对临床诊断及疗效判定等方面具有重要的意义。