氨基酸类神经递质对神经系统的影响及其含量测定方法的研究

杨静涵 张智超 张丹参

河北科技大学化学与制药工程学院，石家庄，050000，中国

神经递质（neurotransmitters，NTs）广泛分布在哺乳动物中枢神经系统和体液中，对人和动物的情绪、觉醒和认知都起重要作用。NTs 主要分为氨基酸、单胺、多肽类神经活性物质。NTs 浓度失衡会导致多种疾病，如抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）等［1］。学习记忆能力下降是AD 等痴呆性疾病的主要表现，与脑内氨基酸关系密切。氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称，是蛋白质的构件分子。氨基酸类神经递质是脑内重要的一类神经递质，分为兴奋性和抑制性两类，人脑的功能取决于兴奋性氨基酸神经递质和抑制性氨基酸神经递质之间的平衡［2］。许多中枢神经系统疾病与氨基酸类神经递质密切相关，测定它们的含量变化是研究中枢神经系统疾病的重要指标［3］。

1 氨基酸类神经递质

根据对中枢神经系统（central nervous system，CNS）作用的不同，哺乳动物氨基酸类递质分为两类：①兴奋性氨基酸递质：谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）等；②抑制性氨基酸递质：γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、甘氨酸（glycine，Gly）等。

1.1 兴奋性氨基酸对神经系统的作用

脑内兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）通过位于神经元细胞膜上的受体发挥多种生理效应，EAA 受体几乎存在于所有神经细胞上，在兴奋性突触传递、神经元可塑性（发育、学习记忆）等方面起重要作用。

关于兴奋性氨基酸兴奋毒性的机理，涉及神经元去极化，神经元肿胀，Ca2+内流和第二信使等一系列复杂的过程［4］。研究发现，EAA 对于神经细胞具有强烈的兴奋性，直接将一定量的Glu 或Asp 注入动物大脑，会引起惊厥。生理条件下，Glu 主要是作为兴奋性神经递质，同时又是GABA 的前体物质，其浓度过高会产生神经毒性。此外N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid，AMPA）受 体激活导致Ca2+内流以及Ca2+在线粒体内快速的堆积，使得线粒体功能丧失。NMDA 受体的兴奋还可增加一氧化氮合酶的活性，使一氧化氮合成增加导致神经细胞的毒性作用。Glu 作用于G 蛋白偶联受体，抑制超极化电流，使神经元兴奋性增高，还可通过突触调制改变Glu 自身及GABA 的释放及突触的可塑性，间接改变神经元的电活动。

1.2 抑制性氨基酸对神经系统的作用

中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质是GABA，GABA 在脑内广泛分布，对GABA 敏感的神经元主要集中于下丘脑、丘脑、大脑皮层，具有兴奋抑制、抗癫痫、神经保护的作用，临床上许多的镇静催眠药都是通过结合GABA 受体增强GABAA受体突触后作用的。Gly 在调控神经元兴奋性方面也发挥重要的作用，Gly 能神经元主要集中在脊髓和脑干，而且在间脑和中脑也有表达。Gly 的受体和GABAA受体属同一家族，作用与GABA 类似，主要功能是对运动和感觉抑制性调控。

GABA 能够降低大脑兴奋性从而抑制突触传递。研究表明Glu/GABA 比值过高会产生细胞毒性作用，导致神经元受损出现认知障碍，而比值过低也会抑制突触可塑性形成和记忆的存储［2］。

2 脑内氨基酸含量测定的方法

目前，脑内氨基酸含量测定的方法有氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、气相色谱法等，现对这些方法进行归纳总结，以期为研究者准确快速测定脑内氨基酸含量提供参考［5］。

2.1 氨基酸分析仪测定法

基于Moore 和Stein 的工作，专属性较强的氨基酸分析仪得以问世［6］。氨基酸分析仪作为一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪，基本结构和普通的高效液相色谱相似，在离子交换色谱的原理指导下制成，通常采用磺酸型阳离子树脂分离。用于氨基酸分析仪的样品都需用pH 为2.2 的缓冲液溶解配制，因为血液中氨基酸在低pH 的条件下都是带正电荷的，阳离子树脂本身带有负电荷，两者正负相互吸引结合，且氨基酸所带正电荷越多，结合的越紧密。不同氨基酸与离子交换树脂亲和力由强到弱依次为：碱性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羟基氨基酸，实现对氨基酸的分离之后，采用茚三酮衍生，可见光光度检测，实现了对氨基酸检测的目的。此种基于柱后茚三酮衍生、离子交换色谱原理制成的氨基酸分析仪被认为是生物样品中氨基酸分析的金标准，因此，氨基酸分析仪仍然是目前临床实验室中最常用的方法，该方法主要缺点是分析时间长和样品用量大。

氨基酸分析仪也可利用阴离子交换分离后经积分脉冲安培法原理检测，该检测方法无需将待测氨基酸进行柱前或柱后衍生，稳定性、重现性与高效液相色谱法接近，但其易受血液样品中蛋白、糖类、细菌等的干扰，测定血液氨基酸含量时的准确度稍低［7］。血液中的氨基酸用专属仪器进行检测，样品前处理较为简单，在血清中加入6%磺基水杨酸沉淀蛋白，离心（3 000 r·min-1）15 min，取上清液稀释后即可上机分析。Smon 等［8］用氨基酸分析仪分析儿童血浆中的14 种氨基酸，该方法重复性好，分辨率高，可以检测具有代谢疾病患者的氨基酸水平。从氨基酸分析仪整体性能来看，此类仪器技术门槛较高，多依赖于进口，价格较贵，较长的分析时间（2.5 h），灵敏度与高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）柱前衍生方法相比稍低（HPLC：<0.5 pmol；氨基酸分析仪：<10 pmol），但该检测方法在操作简便性、分离度、重现性、运行成本等方面都优于其他分析方法。

2.2 高效液相色谱法

HPLC 是在20 世纪60 年代末70 年代初发展起来的一种新型现代分离分析测试技术，经过不断改进，现如今已成为应用广泛的化学分离分析技术手段。它在经典液相色谱基础上，引入气相色谱理论，采用高压泵、高效固定相及高灵敏检测器，因而具备“四高一广”的特点，即高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。进样方法也越来越自动化，从之前的手动进样到现在全自动进样，并且高效液相色谱对化合物结构的破坏性小，适合有机分子及生物分子分离分析。

HPLC 或毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）通常会结合各种检测方法，如紫外检测（ultraviolet，UV），荧光检测法（fluorescence detection，FLD），电化学检测（electrochemical detection，ECD），激光诱导荧光检测，化学发光检测（chemiluminescence，CL）和质谱法（mass-spectrography，MS）。然而，UV、FLD 和CL检测对多个氨基酸和NTs 检测灵敏度差，且由于电极污染，ECD 检测重现性差。因为检测基于分子质量和化学结构，质谱法在分析选择性方面具有显著优势。

液相色谱中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测器高，近年来，越来越多的研究人员选择荧光检测器确定血液或组织样品中氨基酸的含量，但是液相色谱能分离检测的对象，多数没有荧光，主要依靠荧光衍生化试剂通过衍生化反应在目标化合物上接上能发出荧光的生色基团，达到荧光检测的目的。张夏薇等［9］使用高效液相-紫外检测器，结合柱前衍生的方法检测出了脑组织样品中四种氨基酸的含量，线性关系良好。白洁等［10］采用柱前衍生-高效液相色谱法同时测定血清中氨基酸类及单胺类神经递质的含量，除了单胺类神经递质多巴胺（dopamine，DA）的检测限未达到要求，牛磺酸（taurine，Tau）、Glu、Gly、γ-GABA 各项指标均良好。

2.3 液相色谱-质谱联用法

质谱（mass spectrometry，MS）分析法是通过将待测物质的原子或分子在高速电子流的冲击下转变带正电荷的离子，然后经加速运动形成离子流，离子流在磁场（或同时在电场和磁场）的作用下，按照各种离子的质量与其所带电荷量的比值，即质荷比（m/z）大小顺序分离开来，形成有规律的质谱图，并用检测器记录下来，进行定性、定量、结构分析的方法。质谱法几乎是唯一一种能够准确确定有机化合物分子式的方法。质谱法分析灵敏度高，比紫外或荧光检测器的灵敏度要高1～2 个数量级以上，检出限可达10-14g 数量级，适用于痕量分析［11］。此外，质谱法可以提供丰富的分子碎片信息，用于分子结构分析［12］。

在色谱-质谱法中，质谱可以和气相联用如GC/MS，也可以和高效液相联用如HPLC/MS。并且对于质谱检测器，衍生化过程不是必需的，但为提高血液样品中氨基酸检测的灵敏度和特异性，液相色谱-质谱联用法也常采用一些衍生剂。黄鑫等［13］建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测大鼠海马和大脑皮层中生物胺类及氨基酸类神经化学物质含量的方法，电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）在正离子模式下，选择多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）扫描，对检测的6 种生物胺类和11 种氨基酸类神经化学物质分别选择一个定性离子对和一个定量离子对。测定wistar 大鼠海马和大脑皮层中6 种生物胺类和11 种氨基酸类神经化学物质的含量，对比两种不同脑组织样品前处理方法对神经化学物质含量测定结果的影响。无需衍生化，17 种神经化学物质在10 min内即可完成同时测定，检测方法线性关系良好，日内和日间精密度、加标回收率和重复性满足分析要求。由于色谱和质谱灵敏度相当，另外分离效果很好的色谱可作质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪器分析速度快，分离好，应用广。高效液相色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。

2.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）是以弹性石英毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具有分析效率高、分析时间短的优点，其基本原理是根据带电物质在电场中的电迁移率不同来对混合物进行分离［14］。由于质谱的选择性和专一性可弥补样品迁移时间的不足，同时提供分子量和结构信息，在毛细管电泳法对于生物样本的分析中，采用质谱检测比UV 检测或电化学检测更通用。毛细管电泳-质谱联用法可以为分析体积少的血液样品（如干燥的血斑）提供氨基酸谱分析的高效微量分离平台。相关研究［15］采用毛细管电泳-质谱联用法，对血浆中的高半胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的含量进行检测并定量，采用二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）和乙腈沉淀蛋白，结果显示，准确度重现性均较好。另有研究表明［16］，毛细管电泳-质谱联用可在3 min 内有效地检测血液样品中的苯丙氨酸，用于筛查新生儿苯丙酮尿症，仅需采用极少的血液样本量，即可展现较高的灵敏度和准确性。采用此种方法，蛋白质的去除是关键，血浆中蛋白质会吸附在毛细管壁上，出现蛋白质变性和毛细管堵塞等问题。

2.5 气相色谱法

气相色谱法分析氨基酸前首先需要将氨基酸衍生为易于气化的衍生物。赵楠等［17］探究了气相色谱结合负化学离子源质谱（GC-NCI-MS）法对脂肪酸、有机酸、氨基酸的同时定性、定量方法，并且对氯甲酸酯类和硫酸-甲醇溶液两种衍生方式做了比较。Hanff 等［18］采用气相色谱联用质谱法测定血浆中的氨基酸，先用酸化的甲醇溶液将氨基酸酯化，再用酸酐进行酰胺化，以实现电子捕获型负离子化学电离，气相色谱联用质谱法具有选择性好、分离时间短、灵敏度高的优点，但其衍生步骤复杂、衍生反应干扰多，不适用于不耐热氨基酸，不能用一根色谱柱实现全氨基酸测定，目前在血液氨基酸测定方面应用并不广泛。

3 衍生化试剂在氨基酸含量测定中的应用

液相色谱中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测器高，但是液相色谱能分离检测的对象，多数没有荧光，主要依靠荧光衍生化试剂通过衍生化反应在目标化合物上接上能发出荧光的生色基团，达到荧光检测的目的，常用的衍生剂有异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴脂（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）、OPA-FMOC联用、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxylsuccinyl carbamate，AQC）等［19］。DNFB 衍生过程中能够产生对测定结果有干扰的副产物，PITC 衍生试剂具有挥发性且具有较大毒性，需真空干燥装置去过量衍生剂；FMOC 衍生过量的反应剂必须用戌烷萃取除去［20］；OPA 衍生产物在室温不稳定，分解率高；Dansyl-Cl 反应活性较差，反应速度慢，且易生成多级衍生产物干扰测定。AQC 可与伯胺和仲胺反应生成稳定的衍生物脲，其衍生物有很强的紫外吸收和荧光吸收，衍生操作简单，衍生速度快，过量的试剂能自然水解，不需要特殊的处理或提取；而且还不受样品基质、大量电解质、维生素和微量元素的干扰，特别适用于食品等复杂基质中氨基酸的分析［21］。

传统衍生化试剂在应用中有或多或少地限制，如稳定性差、检测灵敏度低，操作不便，衍生化试剂的合成困难，色谱分离干扰严重等。继续开发新型质谱增敏衍生试剂用于复杂基质中痕量物质的温和、快速、灵敏度高、多种成分同时检测分析，具有十分重要的意义。

综上，血液和组织中的氨基酸类神经递质检测技术主要有氨基酸分析仪、高效液相色谱仪及液相色谱-串联质谱仪等。GB 5009.124-2016 采用的是离子交换茚三酮柱后衍生的方法，该方法中使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵，用途专一，灵活性差，大大限制了其推广和使用。而液相色谱分析法，普适性广，具有分析速度快，灵敏度高，操作简单等优点，已成为检测氨基酸的首选方法。因氨基酸和牛磺酸属于极性大且无紫外吸收的一类化合物，故需进行衍生化。当今，基于质谱法的技术越来越多的用于生物样品的多种代谢物分析，以进行靶向代谢组学研究。超高压液相色谱是一种新型液相色谱技术，可显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期。超高压液相色谱质谱联用（ultra high pressure liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）已经成为氨基酸分析的一种很有前景的方法［22］。超高效液相色谱与多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式的串联质谱（UPLC-MS/MS）结合，可在短时间内进行色谱分离，快速、灵敏和特异性地定量多种分析物。