男性不育病人620例的遗传学因素调查 *

武艾宁, 戴晓怡, 于荣鑫

(内蒙古医科大学附属医院妇产科,内蒙古呼和浩特010050)

不孕不育是世界范围关注的生命健康问题,有统计资料显示[1,2],不孕不育的发生率高达10%～15%,其中因男性问题导致的不育症接近50%,以严重少精、弱精、畸精和无精子症等为主要表现形式。造成生精功能障碍的原因有多种,其中遗传缺陷(如染色体异常和基因突变)导致的不育病因占有重要地位。为了进一步明确男性不育症的遗传病因,本研究对近年来收集到的部分原发无精子与少精子症病人进行细胞遗传学核型分析和AZF基因缺失筛查,旨在为不孕不育的病因学研究及指导再次生育提供参考。

1 资料与方法

1.1 病例资料

收集2012-03～2018-05期间内蒙古医科大学附属医院遗传咨询门诊、生殖中心就诊的男性不育病例620例,年龄21～47岁,平均29.3±4.2岁,均无生育史。纳入标准:(1)排除女方不育因素;(2)排除精索静脉曲张,隐睾,梗阻性无精,逆行性射精,泌尿生殖道感染等引起的不育;(3)对病史资料、遗传学检测信息可能被用于流行病学研究表示知情同意。另选取230例健康男性组成对照组,全部精液参数正常并已生育且年龄与病例组匹配。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1精液分析 按照WHO诊断标准进行精液常规分析,连续三次进行精液分析,3次精液离心后,沉淀涂片均未见精子者为无精子症;平均精子密度<20×106/L者为精液质量异常[3]。

1.2.2外周血染色体检查 抽取外周血0.5mL行淋巴细胞培养,常规制备G显带,GSL120染色体自动分析系统自动采集分裂相图像,每例计数20个核型,分析5个染色体核型,对异常核型加倍分析及计数,保存全部图像,必要时做C显带或N显带。核型标准参照人类细胞遗传学国际命名体系(ISCN2009)[4]。

1.2.3Y染色体微缺失(AZF)及AZFc区部分缺失的分析 不育病例根据精液分析参数进行分组,即无精子症组和精液质量异常组,同时增加健康对照组。采用亚能生物技术(深圳)有限公司提供的AZF试剂盒进行多重PCR实验,设定AZF区域15个STS位点,分别为:AZFa(sY82、sY84、sY86)、AZFb(sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143)、AZFc(sY239、sY242、sY254、sY255)、AZFd(sY145、sY152)进行多重PCR扩增。对未检测出AZF基因微缺失的受检者并对照组,行AZFc区及其附近STS位点的部分缺失分析;共8个位点分别为:sY1201(677bp)、sY1206(394bp)、sY142(196bp)、sY1258(968bp)、sY1197(453bp)、sY1291(527bp)、sY1191(385bp)、sY1161(330bp)。以上实验过程严格按说明书操作,对结果异常者重复扩增3次。PCR扩增产物分析用2%琼脂糖电泳,经Dolphin-Doc凝胶成像系统进行DNA电泳条带观察。

1.3 判定标准

AZF基因检测,PCR扩增后在2%琼脂糖凝胶电泳,对应位置上未见扩增带的,判定为相应位点的缺失。AZF区域15个STS位点见一个或多个缺失的,判定为Y染色体AZF微缺失。待测标本仅缺失sY1291,而其余七个位点存在,疑似gr/gr缺失;待测标本仅缺失sY1191,而其余七个位点存在,疑似b2/b3缺失;待测标本同时缺失sY1291、sY1191和sY1161,其余五个位点存在,疑似b1/b3缺失。

1.4 统计学分析

所有采集数据信息经编码整理录入数据库,采用SPSS20.0统计软件进行数据处理,分类变量用频数、百分比表示,组间比较采用采用卡方检验和Fisher确切概率法进行,以P<0.05为差异有统计学意义,检验水准α值取双侧0.05。

2 结果

2.1 不育病人的细胞遗传学分析结果

620例不育病人按精液常规结果分组为无精子症组(n=276)和精液质量异常组(n=344);620例不育病人中,核型异常发生率为15.65%(97/620),染色体多态性发生率为5.16%(32/620)。97例核型异常检出者中包括性染色体异常85例,占87.63%;常染色体异常12例,占12.37%(见表1)。

2.2 Y染色体AZF基因微缺失结果

AZF检测显示对照组无AZF微缺失,620例不育病人中AZF缺失率为10.81%(67/620),其中无精子症组缺失率为12.68%(35/276),精液质量异常组缺失率为9.30%(32/344),相比于精液质量异常组,无精子症组Y染色体AZF微缺失率明显升高(P<0.05)。本组不育病人缺失最易发生的区域为AZFc区,占68.7%(46/67),最易缺失的位点为SY152、SY255和SY254(见表2)。

2.3 AZFc区部分缺失在病例和对照中的分布情况

经AZFc区及其附近的8个STS位点的部分缺失分析,发现存在gr/gr型及b2/b3型AZFc区部分缺失类型,对照组、精液质量异常组和无精子症组3组间在b2/b3缺失率的比较,差异有统计学意义(P<0.05);无精子症病人b2/b3缺失率最高,精液质量差病人次之,对照组缺失率最低;此外,gr/gr缺失率的三组间比较无明显统计学差异(P>0.05)(见表3)。

表1 男性不育病人中异常染色体及多态性核型分析结果

表3 各组AZFc区部分缺失率的比较

3 讨论

男性不育最常见的临床表现为无精子和少弱精子等精液异常,一般认为,影响精液质量的主要问题为:染色体核型异常、Y染色体微缺失、精索静脉曲张、输精管梗阻、隐睾、附睾损伤以及生殖泌尿道感染等,其中染色体异常和分子遗传学水平的基因突变所引起的生精障碍估计占到男性不育的30%[5]。维持精子的发生是多基因调控的过程,染色体是基因遗传物质的载体,当染色体结构、数目出现异常或者基因缺失均对精子生成造成影响,导致不同程度的精液质量异常。

既往研究表明[6,7],在导致原发无精子和少精子的遗传因素中染色体核型异常是最常见的,本组研究中不育症病例中共检出异常核型病人97例,核型异常发生率为15.65%,与部分研究结果近似。本研究结果显示,97例核型异常者共检出性染色体异常85例,常染色体异常12例,分别占到核型异常人群的87.63%、12.37%,由此表明在染色体核型异常的男性不育病人中,性染色体异常是导致不育的最主要原因。其结果在于当性染色体的结构产生畸变时,将会导致某些基因功能的丧失,而性染色体数目的改变,可使多余的染色体产生剂量效应影响正常生精功能。

国内外多数研究表明,Y染色体微缺失是导致男性不育的第二大遗传学因素,Y染色体长臂1区1带存在有与精子生成有关的遗传因子,称为无精子因子(azoospermiafactor,AZF)。AZF区域的缺失是生精障碍的重要原因。Mohseni等[8]的一项大样本研究及整合分析提示,在无精子症和严重少精子症的病人中AZF微缺失率可能占到15%。国内学者等报道原发无精症Y染色体AZF微缺失率达8.9%,严重少精症病人AZF缺失率约5%～7%,且缺失率的种族与地域差异不显著。多项研究证实[9～11]AZF缺失病人少精子的症状有进行性加重及遗传放大的可能。一般情况下,常规染色体核型分析不能评估Y染色体微缺失情况,只有通过分子检测才能明确。最新研究证实,AZF家族共有AZFa、AZFb、AZFd、AZFc四个区域,本研究根据此划分选择15个STS位点进行PCR,共检出AZF缺失67例,AZF缺失率为10.81%,相比于精液质量异常组,无精子症组Y染色体AZF微缺失率明显升高(P<0.05)。既往研究显示[12],在不育病人中AZFc区缺失率最高,且存在众多缺失类型。推断与AZFc区接近高度重复异染色质区,遗传物质比较容易缺失有关,Y染色体AZFc区分布着Y染色体上数量最多的睾丸组织特异性表达基因,由多种独特的扩增子家族构成,众多的Amplicons可发生同源重组,同源重组常造成部分基因拷贝的缺失[12],反向的相同Amplicons可在发生染色体内倒位后形成新的Amplicons排列[11],在其后的某一代中发生同源重组,故AZFc区同源重组导致的缺失类型种类众多,临床表现多样,可以从正常到无精症。本研究不育病人缺失最易发生的区域为AZFc区,占68.7%(46/67),本研究与部分文献报道相符。在AZFc中存在着各种类型的部分缺失,本研究对部分缺失类型进行了分析,其中gr/gr缺失在AZFc区部分缺失中发生率较高,b2/b3缺失也较为常见,本研究同时发现b2/b3缺失率在对照组、精液质量异常组和无精子症组3组间存在统计学差异(P<0.05),而gr/gr缺失率在上述三组间比较无统计学差异(P>0.05),提示b2/b3型缺失可能是男性不育的一个遗传因素。目前多数研究认为,b2/b3型缺失导致男性不育的机制可能与DAZ3/DAZ4型缺失有关,而gr/gr缺失影响男性生育力的证据缺乏,但也有研究表明gr/gr缺失为生精异常的高风险因子[12]。有关AZFc区缺失类型及不同类型的缺失机制尚有待于进一步研究。

综上所述,男性不育的病因复杂,遗传学致病因素与男性不育关系密切,其中染色体核型异常和AZF基因微缺失是主要影响因素,Y染色体AZFc区b2/b3缺失可能是男性不育的高风险因子。对男性不育症人群进行细胞与分子遗传学技术联合诊断有助于指导临床优生并避免辅助生殖技术引起遗传效应。