凉血通瘀方改善脑出血大鼠行为学评分、抗炎作用的研究

黄天马，李建香，顾恒，过伟峰*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210046；2.南京中医药大学附属南京市中医院，江苏 南京 210022)

脑出血属于中风范畴，占我国所有卒中发病率的10%～30%，急性期病死率、致残率高，血肿形成后易继发二次脑损害。临床主要使用脱水、降颅压及手术治疗等治疗，但效果均未达到预期[1]。国医大师周仲瑛认为,瘀血阻于脑络，脑络不通致蒙蔽清窍、火邪迫血妄行，灼伤脑络，络破而血溢出脉外，两者合而为病，基于此创制了凉血通瘀方治疗急性脑出血，以通腑泻热、凉血散瘀为治疗方法。通腑泻热法体现了中医学“上病下取”“脑病治肠”的理念[2]。

颅内血肿形成后，炎症反应贯穿了脑出血发展的所有阶段[3]。本实验采用凉血通瘀方干预脑出血大鼠模型，从行为学评分的改变、凉血通瘀方对炎性因子TNF-α、IL-1β及NF-κB通路的影响，探讨凉血通瘀方的抗炎作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量200～250 g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(浙)20140001。饲养于南京中医药大学实验动物中心，5只/笼，12 h/12 h光暗交替，恒温恒湿。适用性饲养1周，自由饮水摄食。本实验方案由南京中医药大学实验动物伦理委员会审核(201805A026)通过。

1.2 药物

凉血通瘀方：大黄10 g，水牛角30 g，生地黄20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g。以上中药材由安徽沪春堂中药饮片有限公司一次性购入，南京中医药大学附属南京中医院制剂室煎制。常规方法水煎过滤、加水复煎过滤，合并2次滤液，浓缩至每毫升含生药1.2 g。

1.3 主要试剂及仪器

大鼠TNF-α ELISA试剂盒、大鼠IL-1β ELISA试剂盒(南京奥青生物技术有限公司)；兔抗鼠NF-κB p65抗体(美国Cell Signaling公司)；10%水合氯醛(上海麦克林生化科技有限公司)；生物素标记的羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术)。

脑立体定位仪(成都泰盟软件有限公司)；注射泵控制器(保定兰格恒流泵有限公司)；生物显微镜(德国Leica公司)；微量进样器(上海光正医疗仪器有限公司)；酶标仪(美国PerkinElmer公司)。

2 方法

2.1 实验动物建模及分组

对大鼠称体质量并编号，采用改良注射泵控制器注血/二次退针法[4]，制备大鼠脑出血模型；造模完成后，待大鼠苏醒，使用Longa评分法评估大鼠，选择1～3分的大鼠纳入造模合格标准。

选取正常大鼠15只作为正常组，45只符合造模合格标准的大鼠随机分为假手术组(开颅后仅插入进样器但针头不注血)、模型组、凉血通瘀组(造模完成3 h后开始灌胃用药，给药量为1.3 mL/100 g体质量，每日灌胃1次，连续5日)。上述4组大鼠，每组设立用药后24 h、72 h、120 h 3个时间点，每个时间点5只。

2.2 行为学评分

采用Longa五级评分法[5]，记录大鼠行为学评分改变。标准见表1。

表1 Longa五级评分法行为学评分标准

2.3 ELISA法检测脑组织TNF-α、IL-1β的表达

实验完成后，对脑出血大鼠进行取材，将每组各时间点的大鼠脑组织进行取样，并进行处理后保存备用。取检测脑组织TNF-α、IL-1β的ELISA试剂盒按照说明书进行操作。在酶标仪上测定450 nm波长处吸光度(OD值)，按照公式计算样本浓度。

2.4 免疫组化法检测NF-κB p65表达

将经过处理的组织石蜡切片脱蜡水化、修复抗原后，使用山羊血清进行封闭并孵育过夜。经DAB显色于显微镜下观察，使用苏木素复染后脱水、中性树胶封片。切片使用生物显微镜观察，每张切片挑选5张背景光一致的200倍视野照片。用Image-Pro Plus 6.0软件分析，根据公式求取平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 行为学评分比较

统计后发现假手术组大鼠在所有时间点的行为学评分均为0。模型组大鼠在3个时间点均出现了神经功能损害现象，程度不一。与假手术组比，P均<0.05。凉血通瘀组大鼠在72 h时间点行为学评分已明显低于模型组(P<0.05)，并持续降低。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点行为学评分比较分)

3.2 炎症因子TNF-α、IL-1β的ELISA测定结果比较

相比于假手术组，模型组脑组织TNF-α在3个时间点均升高(P<0.01)；相比于模型组，凉血通瘀组脑组织TNF-α在3个时间点均降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠在不同时间点脑组织TNF-α水平比较

在全部3个时间点，模型组脑组织IL-1β均明显高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组在3个时间点均明显低于模型组(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠在不同时间点脑组织IL-1β水平比较

3.3 免疫组化测定NF-κB p65结果比较

在24 h时间点，模型组大鼠NF-κB p65明显高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组高于假手术组(P<0.05)，低于模型组(P<0.05)；在72 h时间点，模型组显著高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组与假手术组相比无统计学差异(P>0.05)，低于模型组(P<0.01)；在120 h时间点，模型组显著高于假手术组(P<0.01)，凉血通瘀组与假手术组相比无统计学差异(P>0.05)，低于模型组(P<0.01)。见表5。

表5 各组大鼠在不同时间点NF-κB p65水平比较

4 讨论

在脑出血的发生及病情发展变化中，炎性反应可贯穿于脑出血整个病理过程的各个阶段。脑出血发生后，可引起多种细胞因子的分泌，而其中某些因子被证实为生物标志物，如核转录因子NF-κB、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等[6]。这些因子可以直接或者间接的参与到脑出血后病理过程的炎症反应中，近年来成为研究热点之一。

作为NF-κB家族重要成员之一的p65受到刺激后活化，进入细胞核，诱导众多细胞因子的表达[7]，不断促进炎症的发生发展。在大量分泌的细胞因子如TNF-α、IL-1β的刺激下，巨噬细胞、星形胶质细胞被持续激活，从而导致了血脑屏障通透性的破坏，再次加重脑水肿，脑的继发性损害不断持续上升。炎性反应在脑损害-神经功能受损-继发性脑损害的恶性循环中级联放大[8]。

脑出血发生以后，NF-κB通路的活化、刺激TNF-α、IL-1β的大量分泌是继发性脑损害的罪魁祸首之一。如何降低、防治脑出血后的继发性脑损害成为了近年来国内外的研究热点，而中医药治疗脑出血在临床实践中取得了良好的疗效，通过中医药治疗是否可调控NF-κB的活化，成为了新的研究思路与方法。

本实验选取了国医大师周仲瑛所创的凉血通瘀方，使用该方干预脑出血大鼠模型，选取行为学评分作为脑神经功能损害指标，并测定脑组织中NF-κB、TNF-α、IL-1β的表达，从炎症的发生发展机制探寻凉血通瘀方在脑出血大鼠模型中的抗炎作用。实验结果揭示了使用凉血通瘀方24 h后，持续降低NF-κB p65的表达，NF-κB通路活性降低，TNF-α、IL-1β的含量显著低于模型组，证实了凉血通瘀方通过抑制NF-KκB通路的活化，降低TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，减少损害性炎症发生，改善了脑出血大鼠的神经功能缺损，发挥了抗炎作用。

综上所述，凉血通瘀方能够调控脑出血大鼠NF-κB通路活化、抑制炎性因子的分泌，从而减轻炎症反应的发生、降低炎症的级联放大效应，改善了脑出血大鼠的行为学评分，发挥抗炎作用。本实验依托于名老中医的有效验方，结合当前新的研究思路与方法，为本方的作用机制提出了新的科学解释。