细胞周期检测点激酶与肺癌耐药研究进展

柯芷茵 梁爱玲 刘勇军

肺癌是最常见的诊断癌症和癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的85%[1]。在男性中，肺癌是最常见的癌症（占癌症病例总数的14.5%），也是癌症死亡的主要原因（占癌症死亡总数的22.0%）。在女性中，肺癌是仅次于乳腺癌的最常见癌症死亡原因（占癌症死亡总数的13.8%）[2]。与大多数国家相比，中国的肺癌死亡率相对较高。据预测，至2030年中国的肺癌死亡率可能增加约40%[3]。近年来，虽然手术、化疗、放疗等常规治疗手段取得了很大进展，但肺癌整体5年生存率仅为15%。靶向治疗的出现给肺癌的治疗带来了革命性的变化，但获得性耐药的出现不可避免地阻碍了治疗的效果[4]。

肿瘤是一类细胞周期调控机制破坏的疾病，在细胞周期进程的整套监督体系中，细胞周期检测点发挥着核心的作用。Chk1和Chk2是细胞周期检测点中非常重要的蛋白激酶，它们通过信号传导和放大，调节下游靶蛋白活性与表达，使细胞周期出现阻滞[5]。化疗药物耐药是导致肿瘤患者复发、治疗难度加大、治疗失败和预后不良的重要原因，而DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）是影响肿瘤化疗耐药的一个重要途径，靶向DDR成分中DNA修复相关激酶或检测点可以提供新的解决方案。近年来，调控DDR这一过程中，Chk1及Chk2分子引起了国内外学者的广泛关注，人们期望引发有丝分裂灾难从而促进细胞死亡，而Chk1和Chk2正是癌症治疗中有前景的靶点[6]。目前已有Chk抑制剂应用于临床，并在肺癌中取得了成效，其通过诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞，从而逆转细胞周期失调引起的获得性耐药。

1 Chk概述

Chk1，最初在1993年发现，是一种丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，在裂殖酵母菌的DNA损伤反应中控制着G2期/M期的转变。人类Chk1基因位于染色体11q22‐23，由476个氨基酸残基组成，在进化上高度保守。同时，Chk1也是脊椎动物细胞中DNA损伤和复制检查点的主调节因子，在调节细胞周期和参与DNA损伤修复中发挥着关键作用，并且可以影响细胞的存活和凋亡[7]。

Chk2，由N端SQ/TQ簇结构域（SQ/TQ cluster domain,SCD）、中心叉头相关结构域（forkhead associated domain,FHA）和C端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（kinase domain,KD）构成。人类Chk2基因位于染色体 22q12.1，由543个氨基酸残基组成。Chk2是DNA损伤反应的关键调节因子和肿瘤抑制因子，也是细胞存活和各种病理生理过程的重要监督者，参与促进细胞周期阻滞、凋亡和DNA修复[8,9]。

人类基因组DNA常常受到多种因素的威胁，包括来自内部和外部因素的影响，如复制应激、电离辐射、X射线暴露和化疗药物等。这些因素的共同作用，使得DNA损伤在哺乳动物细胞中反复发生，触发DDR[10]。正常细胞有完整的G1期、S期和G2期/M期检测点，细胞的存活依赖于激活检测点，引起细胞周期阻滞而启动DNA损伤修复系统，而其中参与DDR途径的两种关键检测点激酶，分别为Chk1和Chk2[6]。Chk1使细胞周期停滞在S期或G2期/M 期，阻止DNA受损的细胞进入有丝分裂[11]；Chk2参与细胞周期G1期，S期或G2期/M期的阻滞，促进细胞对损伤进行修复，维持基因组的稳定。P53在控制G1期检测点方面起着核心作用，而大多数癌症由于p53的缺乏导致G1期检测点调控缺陷，迫使癌细胞在DNA损伤后高度依赖于Chk1激活的S期和G2期/M期检测点进行修复[12]。

当发生DNA断裂时，Chk1和Chk2分别由共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶（ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase, ATR）和共济失调毛细血管扩张症突变激酶（ataxia telangiectasia mutated kinase, ATM）磷酸化激活，形成两条经典的信号转导通路，即ATR‐Chk1‐细胞分裂周期蛋白25（cell division cyclin 25, Cdc25）和ATM‐Chk2‐Cdc25信号通路[13,14]。当DNA发生单链断裂（single‐strand breaks, SSBs）时，ATR‐Chk1‐Cdc25信号通路被激活，启动DNA损伤修复系统。上游的ATR将DNA的受损信号通过中介因子传递至Chk1，Chk1定位聚集在DNA损伤位点，并被ATR在Ser317和Ser345这两个位点磷酸化而被激活，然后Chk1磷酸化抑制其下游的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin‐dependent kinase, CDK）激活物Cdc25A，使Cdc25A加速泛素化并降解，从而抑制CDK的激活，促使细胞周期在S期/G2期或G2期/M期阻滞[15,16]。当DNA发生双链断裂（double‐strand breaks, DSBs）时，ATM‐Chk2‐Cdc25信号通路被激活。Chk2基因突变后，其编码的激酶会丧失活性，无法修复损伤的DNA，受损伤的DNA不断复制，产生大量异常细胞，进而导致癌变。Chk2作为一个高度保守的蛋白激酶，在修复过程中起着重要的作用[17]。其在复制缺陷、电离辐射及靶向DNA的药物等时被激活，活化的Chk2可以磷酸化并且稳定20多种底物蛋白，包括细胞周期相关转录因子1（E2F transcription factor 1, E2F‐1）、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1）、P53、Cdc25A、Cdc25C等，使细胞周期发生阻滞，同时激活修复基因的转录，促进细胞对损伤的修复[18]。

2 Chk与肿瘤耐药

大量研究表明，Chk1和Chk2在正常细胞中均有一定程度的表达，但在肿瘤细胞中却表现为表达水平的异常。目前认为，Chk1在肿瘤细胞或组织中高表达，对肿瘤的增殖和生存发挥重要作用；而Chk2在肿瘤中的表达尚不一致，其缺失或过表达都可能会影响肿瘤的发生发展。癌细胞DNA损伤修复能力的增强是获得性化疗耐药的机制之一。随着Chk1抑制剂和Chk1/Chk2双重抑制剂在临床试验中的应用，Chk1和Chk2在肿瘤耐药中的重要地位正逐步得到认可。

2.1 Chk1与肿瘤耐药 目前已经发现Chk1在多种人类肿瘤中过表达，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌和鼻咽癌[19]。值得注意的是，它的表达往往与肿瘤分级和疾病复发呈正相关。研究发现，Chk1高表达的肿瘤细胞更能耐受放疗、化疗或其他肿瘤治疗方法引起的DNA损伤反应，促进产生恶性程度更高的肿瘤细胞，并可导致耐药现象的发生及肿瘤的频繁复发。Nieto等[20]研究发现，抑制Chk1可以克服基底样乳腺癌对顺铂的获得性耐药。Fan等[21]研究发现，沉默Chk1抑制了慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia, CML）细胞的增殖，且增强了依托泊苷（etoposide,VP16）的细胞毒性作用。其通过降低BRCA1的表达，导致细胞周期阻滞，削弱同源重组（homologous recombination,HR）修复。Nair等[22]研究发现一种治疗高级别浆液性卵巢癌的新机制，在Chk1抑制剂的作用下抑制HR，使肿瘤耐药细胞对脱氧核糖核酸损伤剂如吉西他滨或羟基脲敏感，从而导致细胞有丝分裂灾难和细胞死亡。由此可见，抑制Chk1或其抑制剂与产生DNA损伤的药物（如铂化合物、吉西他滨和PARP抑制剂奥拉帕尼）可以在体外对肿瘤迁移、侵袭能力和细胞凋亡有协同作用。靶向DNA修复机制已经在临床得到应用，Chk1抑制剂联合一线抗肿瘤药物，比单独或双联用具有更高的活性，导致更高的凋亡效应。

2.2 Chk2与肿瘤耐药 研究[23‐25]发现，在多种癌症的细胞系中也存在Chk2的改变。Chk2已被证实是一种肿瘤抑制因子，并且在一些癌症中发生突变或减少，包括乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。Chk2的低表达或缺失对肿瘤有保护作用，可能与肿瘤的发生发展相关。Luo等[26]研究发现，在三阴乳腺癌Chk2 Y390C突变型MDA‐MB‐231细胞系中，通过激活P53和Chk2‐P53凋亡通路，调控细胞凋亡和细胞周期，可以诱导三阴性乳腺癌细胞对化疗药物耐药。Yao等[27]研究发现，通过抑制ATM‐Chk2‐P53信号通路可以促进结直肠癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，最终导致5‐氟尿嘧啶（5‐fluorouracil, 5‐FU）耐药。Ta等[28]研究发现，前列腺癌患者样本中Chk2的表达下降，认为Chk2是前列腺癌生长的负调控因子，且干扰Chk2信号可能成为治疗前列腺癌的一种新方法。由此可见，Chk2的活化和Chk2的低表达都可能与肿瘤有关，其有助于增加肿瘤的侵袭性，且与部分肿瘤的发生发展、耐药也存在一定的相关性。然而，另有相关研究[29]发现，Chk2在食管癌、肝癌、胃癌、高级别浆液性卵巢癌等肿瘤中却存在高表达。因此，对于Chk2和肿瘤之间的调控机制，还需进一步的研究和探讨。

3 Chk与肺癌耐药

随着肺癌治疗药物在临床的广泛使用，其耐药性问题越来越突出，已经成为临床治疗的主要障碍。当发生DNA受损时，Chk可通过诱导细胞周期延迟或阻滞，为DNA损伤修复提供时间。近年来，关于Chk表达及其抑制剂与肺癌耐药的研究越来越多，通过解除S期和G2期检测点可提高DNA损伤试剂对癌细胞的灵敏度并提高其选择性。有研究[30]表明，不仅可以通过应用Chk抑制剂联合化疗或放疗来逆转肺癌耐药，也可以通过单独使用Chk抑制剂终止癌细胞的增殖。

3.1 Chk1与肺癌耐药 正常细胞中Chk1的表达极低，而在肺癌组织中，约90%存在Chk1的表达，其基因和蛋白的异常表达能诱导细胞恶性增殖，进而促使肿瘤的进展。研究认为，当Chk1被抑制时癌细胞会失去对DNA损伤的反应和修复能力，从而增强放化疗对细胞的杀伤力。Cai等[31]研究发现，F‐box蛋白成员Fbxo6，可以通过降低NSCLC中Chk1的表达和磷酸化，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，提高对顺铂（cisplatin, DDP）的敏感性。由此可见，Fbxo6可能是一种有效的治疗靶点，可以克服铂类化疗药物在NSCLC患者中的化疗耐药性。Duan等[32]研究发现，一个组蛋白去甲基酶家族JMJD2s，其化学抑制剂使顺铂耐药NSCLC细胞敏感化。抑制JMJD2降低了ATR和Chk1的染色质关联，并抑制了ATR‐Chk1复制检测点，结果表明，JMJD2去甲基化酶是克服顺铂耐药的潜在治疗靶点。

与此同时，通过解除Chk1对细胞周期检测点的阻滞作用进而促使肿瘤细胞凋亡，这一机制成为了目前肿瘤研究的新热点，同时也是众多学者寻找潜在的Chk1抑制剂的研究基础。目前已有多种Chk1抑制剂应用于临床，或进入临床试验阶段。

AZD7762是一种强效的Chk1/2双抑制剂，也是一种ATP竞争性药物，能够抑制Chk1介导的Cdc25C磷酸化[33]。Grabauskiene等[34]研究发现，与低Chk1表达的H1993细胞相比，AZD7762抑制Chk1会优先使高Chk1表达的细胞H1299对抗代谢药物化疗敏感。其对于Chk1蛋白表达水平较高的肿瘤亚群有更强的治疗效果。AZD7762联合化疗药物可降低肿瘤生长，尤其是p53突变或缺失的肿瘤。Hsu等[35]研究发现，联合AZD7762与DDP可以通过激活caspase‐2和下调E2F‐1，协同诱导p53缺失的小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）细胞有丝分裂死亡，抑制Chk1增强了DDP的抗肿瘤活性，并克服了SCLC对DDP的耐药性。

LY2606368（Prexasertib）是一种Chk1/2双重抑制剂，在体外优先结合并抑制Chk1[36]。Zhao等[37]研究发现在SCLC中，细胞周期调节因子Wee1的DNA拷贝数、mRNA和蛋白水平与细胞耐Prexasertib的程度呈正相关。Wee1 siRNA或Wee1抑制剂可逆转SCLC细胞对Prexasertib的耐药；而Wee1转染可诱导细胞中的Prexasertib耐药性。联合应用Chk1和Wee1抑制剂可能为SCLC的治疗提供一种新的治疗策略。

MK‐8776是一种选择性Chk1抑制剂，在异种移植模型中与DNA抗代谢物羟基脲、吉西他滨或培美曲塞联合使用时，可诱导DSBs和细胞死亡[38]。Dai等[39]研究发现，减少范可尼贫血互补群基因D2（Fanconi anemia complementation group D2, FANCD2）联合MK‐8776显著增强了吉西他滨对两株肺癌细胞SK‐MES‐1和KLN205的细胞毒性。吉西他滨作用的增强伴随着DNA修复功能的丧失和DNA单链断裂和双链断裂的积累，同时caspase‐3依赖性凋亡明显增加。

由此可见，抑制Chk1或使用Chk1抑制剂可能在肺癌耐药治疗中发挥着对药物增敏的作用。然而，也有研究表明，Chk1可能并不是肿瘤抑制因子，相反，它促进肿瘤生长，对抗肿瘤药物产生耐药。研究[40]还发现过度激活Chk1对肿瘤细胞的生长反而有害，因此认为通过激活而不是抑制Chk1可以达到杀死肿瘤细胞的目的，其可能发展成为癌症治疗的一种创新方法。

3.2 Chk2与肺癌耐药 Chk2在肿瘤中的表达水平与肿瘤相关性的研究尚不十分清楚，到目前为止，只有少数研究报道了Chk2在原发性患者组织中的表达。与正常组织相比，Chk2在肺癌中表达缺失或下调，低水平的Chk2在肺癌中被认为是导致化疗耐药的原因[41]。Wu等[42]研究发现泛素特异肽酶39（ubiquitin specific peptidase39, USP39）是Chk2的一个新的调节分子。它是一种去泛素化酶，可将泛素化的Chk2去泛素化并稳定Chk2，从而提高Chk2的稳定性。此外，敲除USP39可以导致Chk2蛋白水平显著降低，进而调节G2期/M期检测点和促进细胞凋亡，从而导致肺癌细胞对化疗药物和放疗的耐药。Luo等[43]研究发现，蛋白酶体抑制剂MG132可选择性地上调A549细胞中主要组织相容性复合体I类多肽相关序列B（major histocompatibility complex class I polypeptide related sequence B, MICB）的表达，并增加自然杀伤（natural killer, NK）细胞的细胞毒性。MG132的调控作用可能与Chk2的激活有关，MG132联合NK细胞免疫治疗可能有协同作用，提高肺癌治疗效果。Lin等[44]研究发现，11‐脱氢水杉内酯是一种具有抗肿瘤生物学特性的软珊瑚化合物，其通过上调P53和Bax，激活ATM和Chk2，激活caspase‐3和caspase‐7，诱导G2期/M期细胞周期阻滞和凋亡，从而抑制Akt通路。由此表明11‐脱氢白藜芦醇内酯可能是一种有前途的治疗SCLC的化疗药物。

此外，目前已有学者以Chk2为治疗靶点开发Chk2抑制剂，但研究发现其普遍对Chk1也存在抑制作用，在临床前评估中缺乏特异性。其他临床前数据和早期临床研究表明，Chk1/2双重抑制剂在实体肿瘤中取得了良好的抗肿瘤效果。因此，针对Chk1与Chk2在肺癌的联合研究可能对肺癌耐药的治疗有更重要的意义。

4 总结与展望

肺癌是全球最常见的诊断癌症，也是癌症相关死亡的最主要原因。目前临床肿瘤治疗药物均有不同程度的毒副作用，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常的组织细胞也有损伤作用，且肿瘤细胞几乎都会产生耐药性，尤其是多药耐药性（multidrug resistance, MDR）[45]。因此，开发针对肺癌耐药作用机制的治疗靶点和治疗方法，逆转肺癌耐药，可以为临床针对肺癌的治疗提供新的策略和思路。

Chk在DDR及细胞周期调控中具有重要作用，与肿瘤的发生发展、复发、耐药及预后相关，可能是一个潜在的抗肿瘤治疗靶点。目前越来越多针对Chk特异性的抑制剂被开发，使得它的作用在临床前环境中得到了广泛的探索。研究证实，Chk的表达及其抑制剂的应用对逆转肺癌耐药有一定的效果，但是能否仅通过调控Chk，从而直接抑制肿瘤的发生和进展尚不是非常的明确。此外，除了与化疗药物联合，Chk抑制剂与其他靶向S期和G2期/M期检测点的抑制剂组合能否在肺癌耐药治疗中取得满意疗效，还需进一步探究。虽然Chk抑制剂在化疗增加药物敏感性方面的前景可期，但部分抑制剂的稳定性和安全性还有待进一步的证实。未来，深入了解Chk1和Chk2在肺癌耐药中的作用，将有望提高肺癌的治疗效果，为肺癌患者带来更好的生存及预后。