Ca2+/CaN/NFATc信号通路及其抑制剂与心血管疾病的研究进展

朱明利，唐 碧，康品方，张先林

NFATc基因起源于脊椎动物，参与脊椎动物特有的功能，例如复杂的神经系统、重组免疫系统和具有复杂心脏的血管系统[1]。心肌的生理和病理生长通常由膜结合受体启动，该膜结合受体通过多种GTP酶蛋白、激酶和磷酸酶促进细胞内信号传导[2]。近期研究结果表明，细胞内持续升高Ca2+激活钙调磷酸酶(CaN)使活化的T淋巴细胞的核因子(NFAT)去磷酸化，促进其向核内转运，从而参与T淋巴细胞中各种免疫应答基因以及其他细胞类型中具有多种功能的基因的转录诱导。CaN调节的NFAT转录因子有4种：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4，各自在心肌中表达[3]。Ca2+/CaN/NFATc信号通路在心血管疾病的发生中起重要的作用，认识该信号通路作用机制将为心血管疾病的诊疗提供新的依据。

1 Ca2+

Ca2+是所有真核细胞类型中普遍存在的关键信号传导元素，能调节各种基本的生理过程，例如细胞分化、增殖和运动、凋亡、分泌、兴奋、收缩和神经元可塑性。在心脏中，Ca2+最明显的关键作用是其参与电活动和心脏收缩，除了直接参与兴奋收缩(excitation contraction，EC)耦合外，还是各种信号级联中的重要元素，调节各种下游效应子的活性[4-5]。因此，Ca2+不但可以发挥急性作用，还可以参与基因表达的调控，称为激发转录(excitation transcription，ET)耦合。这些ET偶联途径不仅能够维持心脏动态平衡而且在心脏病的发展中都起着至关重要的作用[6]。

2 CaN

CaN是由催化亚基A(CnA)和调节性亚基B(CnB)组成。CnA包含1个磷酸酶催化结构域、1个CnB结合结构域、1个钙调蛋白结合结构域和羧基末端自动抑制结构域(AID)。活化状态下，细胞质Ca2+浓度的升高有助于钙调蛋白取代AID，并通过激活CnB中的Ca2+结合EF-手基序来促进CnB与CnA的结合，从而导致CaN的活化[7]。活化的CaN使NFAT同源区域(NHR)中的多个磷酸残基去磷酸化，从而导致NFAT胞质-核转运并与内皮转录因子-4(GATA4)协同作用[8]。因此，钙调神经磷酸酶在NFAT脱磷酸作用中起关键作用。

3 NFATc

NFAT的转录因子NFATc家族，有5个亚型：NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)及NFAT5(NFATL1)[2]。NFAT1-4是由NHR、Rel同源区域(RHR)和C端结构组成。NHR包含1个N末端反式激活结构域(TAD)即CaN结合位点，核定位序列(NLS)和核输出信号(NES)，此外其带有SRR1、SRR2、SP1、SP2和SP3富含丝氨酸的基序；RHR包含DNA结合域和具有其他转录结合伴侣(例如Fos和Jun)的识别点[9]。因此，Ca2+/CaN途径调节NFAT1-4，但不能激活NFAT5，因为其缺乏NHR。静息状态下，NFAT位于细胞核中，当NHR丝氨酸基序去磷酸化时，NFAT中的核定位序列(NLS)暴露，导致NFAT蛋白从细胞核转到细胞质[10-11]。

4 Ca2+/CaN/NFATc信号通路的激活

NFAT的显著特征是受Ca2+/CaN途径的调节。NFAT蛋白被磷酸化并驻留在静息细胞的细胞质中，细胞表面的受体与配体结合可诱导磷脂酶C(PLCy)的活化并水解成二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、二酰基甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)[12]。IP3与内质网(ER)膜上的Ca2+渗透性IP3受体(IP3R)结合，并刺激Ca2+从存储区释放到细胞质中，NFAT蛋白受到刺激后，被钙调神经磷酸酶去磷酸化，易位从细胞质转移至细胞核，并具有转录活性。同时细胞质Ca2+的增加导致Ca2+传感器钙调蛋白(CaM)的激活，而CaM进一步激活CaN[13]。因此，细胞内Ca2+/CaN/NFATc信号传导与基因表达之间具有直接联系。

5 Ca2+/CaN/NFATc信号通路与心血管疾病

5.1 Ca2+/CaN/NFATc信号通路与原发性高血压 原发性高血压是最常见的心血管疾病之一，也是心血管疾病的主要危险因素。原发性高血压的发病机制包括遗传、饮食、心理因素以及神经内分泌机制。研究表明，淋巴细胞，特别是T淋巴细胞参与高血压的发生、发展和血管重塑。NFAT的核因子在许多免疫细胞中表达，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞[14]。NFAT钾通道可增强钾离子外排，从而增加细胞膜两侧的电势梯度，产生超极化作用以促进Ca2+流入，引起Ca2+浓度的瞬时增加，以及随后CaN介导的NFAT去磷酸化和NFAT信号通路激活[15]。激活NFAT信号通路并导致进一步的淋巴细胞激活，活化的淋巴细胞产生其他炎性细胞因子，例如白细胞介素(IL)-17，并促进血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)释放。这种包括IL-6、IL-17和AngⅡ在内的炎性环境以及其他细胞因子会促进钠在肾脏系统和血管中的滞留，导致血管收缩和血管重塑，最终导致高血压[16]。

5.2 Ca2+/CaN/NFATc信号通路与冠心病 冠心病是一种以动脉粥样硬化为基本病变的心血管疾病。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号分子家族在心外膜途径控制的冠状动脉发育中起着重要作用[17]。CaN-NFAT通过激活Smad 2的表达，以控制TGF-β/活化素受体样激酶5(Alk5)信号转导对冠状动脉的发育。有研究通过在小鼠心肌实验发现CaN-NFATc3/c4信号通路通过抑制不同血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)配体与受体的结合来控制冠状血管的发育[18]。血管钙化是动脉粥样硬化的主要特征，是一个复杂的过程，与骨骼钙化有许多相似之处。目前研究显示许多因素参与血管钙化，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最主要的因素，其既可以促进动脉粥样斑块的形成又可促进血管钙化[19]。Brown等[20]在研究主动脉平滑肌细胞(BASMC)原代培养中成骨细胞分化的机制发现oxLDL通过增强β-甘油磷酸酯激活Smad 1、Smad 5、Smad 8信号分子促进Runx2、 Osterix(Osx)成骨细胞转录因子表达和血管钙化的形成。有研究发现NFAT信号可以介导oxLDL损伤血管平滑肌，从而诱导血管平滑肌钙化和向成骨细胞分化[21]。

5.3 Ca2+/CaN/NFATc信号通路与心肌肥大 心肌肥大对心室壁张力的增加或神经体液刺激的适应性反应起初有益，但持续的心肌肥大可导致心力衰竭和其他不良心血管事件的发生。目前认为CaN/NFAT信号传导可作为介导多种形式病理性心肌肥大的关键控制点，但该途径需要与其他信号传导效应因子协同作用[22]。已证明有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)影响CaN，NFAT信号传导也受其影响。MAPK信号通路通常分为3个主要分支，包括p38激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)，一旦激活，p38、JNK和ERK就会磷酸化一系列细胞内靶标，其中包括许多转录因子，导致心脏基因表达重新编程为肥大性程序的一部分[23-24]。有研究显示，无论在细胞培养还是整个动物研究发现Ras直接激活Raf-1激酶，从而激活促分裂原激活的蛋白激酶(MEK1)-ERK1/2信号增强NFAT转录活性[1]。此外，显性负性MEK1突变体可以阻断T淋巴细胞中的NFAT活化，即ERK1可以通过一种涉及NFAT蛋白N端调节域内直接磷酸化的机制直接拮抗COS细胞中NFATc1的核输入。这类似于糖原合酶激酶3(GSK3)、JNK1/2、p38、蛋白激酶A(PKA)和酪蛋白激酶1(CK1)这5个激酶直接磷酸化多个NFAT因子中的N末端调节域，从而拮抗CsN介导的去磷酸化和随后的NFAT核易位[25]。

5.4 Ca2+/CaN/NFATc信号通路与心肌纤维化 心肌纤维化是心脏病理性重塑的标志性特征，其病理机制是细胞外基质(ECM)的过量沉积和成纤维细胞(CF)的不断增生，导致心脏僵硬度增加、心脏收缩和舒张功能降低，心脏的正常电生理结构改变会诱发心律失常，甚至猝死[26]。大量证据表明，Ca2+是一种通用的细胞内信使，参与了心脏纤维化。存储的Ca2+(SOCE)是细胞外Ca2+进入细胞的重要机制，基质相互作用分子1(STIM1)和钙释放激活钙通道蛋白1(Orai1)是SOCE的两个主参与者。心肌受到刺激后，成纤维细胞中的Ang Ⅱ激活导致STIM1与细胞内的Orai1和Ca2+相互作用从而引发心肌纤维化级联反应。NFAT途径响应Ca2+信号传导途径，参与纤维形成过程[27]。TGF-β/ Smad途径也是与纤维化相关的重要信号途径，Ang Ⅱ的激活显著上调了转化生长因子-β1(TGF-β1)的mRNA，并增加了TGF-β下游信号标记的磷酸化。研究表明，Ca2+内流激活Smad 2、Smad 3依赖性TGF-β信号传导，从而促进平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和胶原蛋白的表达上调，因此，推测Ang Ⅱ刺激通过SOCE诱导了连续的Ca2+流入，随着胞质Ca2+浓度升高这足以激活CaN/NFAT信号通路以启动转化生长因子(TGF)/Smad途径，最终导致心肌纤维化[20]。

6 Ca2+/CaN/NFATc信号通路抑制剂

CaN-NFAT信号已成为调节心肌和血管平滑肌细胞(VSMC)炎症和增生的关键治疗靶标。目前，临床常用钙信号特异性阻断药免疫抑制剂CsA和FK506通过形成CsA-亲环蛋白或FK506-FKBP12复合物而破坏了CaN的活性。尽管已被证明有效，但在破坏CaN活性的同时也影响了CaN下游信号通路的转导，对机体产生不可避免的副作用和毒性[28]。针对于此开发出针对CaN下游信号NFAT选择性更强、毒性更小的免疫抑制剂VIVIT，其通过阻止CaN和NFAT的蛋白质-蛋白质相互作用来选择性抑制NFAT活化，但不会影响CaN的活性。与传统的钙信号抑制剂CsA和FK506相比，VIVIT显示出更高的选择性，VIVIT可以有效抑制钙调蛋白激活的NFATc1、NFATc2和NFATc3的去磷酸化和NFATc2的核转运，阻断了NFAT介导IL-2、IL-3、IL-13、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性，但不会影响NFAT和促分裂原激活的MEK-ERK通路协同触发VSMC增殖的作用[29]。因此，VIVIT作为选择性NFAT抑制剂是进一步研究的首选。

7 小 结

Ca2+/CaN/NFATc信号通路在心血管疾病(高血压、冠心病、心肌肥大，心肌纤维化)发病机制中涉及的信号通路非常复杂，具体的机制还需进一步探究。目前，开发出的以CaN底物NFAT为靶点的VIVIT免疫抑制剂在体外和体内试验中显示出了无数的前景，其不仅是探索CaN-NFAT信号传导的有用工具，而且还为治疗心血管疾病的新型疗法开辟了道路。