中成药DNA提取方法的研究进展

景晓彤 黄 勇 黄玉婷 蔡 毅

广西中医药大学药学院，广西南宁530200

中成药常见的传统剂型主要有散剂、膏剂、丸剂、酒剂、茶剂、丹剂和锭剂等[1]。随着现代科技不断发展和突破，在中医药理论指导下，中成药剂型取得了很大的改良和提升。现代新剂型取代传统剂型成为临床常用剂型，包括注射剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、浓缩丸和微丸等。中成药的品种数目很多，提取工艺复杂，鉴定难度不断加大，因此需要更为科学、严谨、客观的中成药鉴定技术，才能满足现代剂型中成药鉴定的需要。《中华人民共和国药典》（2020年版）[2]收载用于中成药鉴别的方法主要有薄层色谱法、显微鉴别法、荧光法、沉淀法、显色法、升华法、燃烧法、结晶法等。近年来，由于DNA分子标记技术具有灵敏度高和特异性强等特点，成为国内外中药材鉴定方面的研究热点[3-10]，但是分子鉴定技术应用于中成药鉴定方面的研究较少。

中成药DNA提取质量是开展中成药分子鉴定等研究的前提，同时也关系到中成药基因文库的建立以及分子克隆、高通量测序等技术的研究。在中成药DNA提取过程中，提取方法、纯化技术等对中成药DNA质量有较大的影响。因此，本文对近些年来中成药的DNA提取方法（CTAB法、SDS 法、试剂盒法、磁珠法、乙醇沉淀法）进行系统整理，为中成药分子鉴定深入研究提供理论参考。

1 DNA提取及纯化原理

1.1 破碎细胞

将植物或动物的组织在液氮中研磨。液氮的温度低至-196℃，既能使各组织成分不易被破坏或者降解，又能使组织变硬，质脆，易于研磨。经液氮速冻后，破胞效果更好，能有效释放细胞内物质，同时又可终止细胞内外的一切生物反应，避免DNA酶发生降解，维持基因组DNA的稳定。

1.2 DNA的获取

在细胞核中，DNA存在的形式是和组蛋白结合形成染色质，而离子型表面活性剂如溴化十六烷三甲基胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十二烷基硫酸钠（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等能有效破坏细胞膜，与核酸形成复合物，通过离心的方法，即可使DNA与大分子物质分开，释放出来。

1.3 抽提法去除杂质蛋白质

为去除杂质蛋白质获取DNA，通常采用酚氯仿法单独抽提或反复抽提[11-13]。其原理是细胞核中的DNA通常与蛋白质结合以复合物的形式存在，而利用苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，v/v）或氯仿∶异戊醇（24∶1，v/v）等有机混合液，可使蛋白变性留在有机相或者中间相中，DNA则留在水相中，可以有效去除杂质蛋白质。

1.4 抗氧化法去除次生代谢产物

DNA的提取过程，常夹杂细胞次生代谢产物，如多酚、多糖、色素等，可与DNA共沉淀，形成难溶且易褐变的胶体，使DNA不易分离提取[14]。故提取过程中，应添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇、抗坏血酸等抗氧化剂，避免次级代谢产物与DNA形成胶体，影响DNA的提取进程。

1.5 核糖核酸酶（RNase）消化去除RNA

为获取高质量的DNA，应尽可能地去除其中的RNA。RNase是一种核酸内切酶，可水解RNA，而对DNA无影响，故添加RNase有效去除DNA样品中的RNA，获取高质量的DNA。

2 常用中成药DNA提取方法及特点

中成药DNA提取是基于中成药中药材成分，即动植物等组织的DNA提取。中成药制剂一般分为两大类：一类是原粉末入药，如丸剂、散剂；一类是药材经过深加工入药，如液体制剂、颗粒剂。中成药在制剂过程中，因制剂工艺的要求，需要添加相应的辅料，如淀粉、糊精、蜂蜜、硬脂酸镁和蔗糖等，并按药用处方和质量标准等规范进行深加工，导致多数DNA已降解，仅存部分片段，给中成药的DNA提取带来较大的难度。中成药DNA的提取方法很多，并各具特点，目前固体剂型的中成药多采用CTAB法、SDS法、磁珠法试剂盒；液体剂型的多采用乙醇沉淀法[15]。

2.1 CTAB法

CTAB法属于阳离子去污剂，它可以使细胞膜溶解，并与核酸形成复合物。它溶于高盐溶液（0.7 mol/NaCl），在低盐溶液（0.3 mol/NaCl）中，通过离心与蛋白质、多糖类等进行分离。加入乙醇时，核酸形成沉淀，CTAB溶于乙醇[16-17]。CTAB法常用的操作步骤：将样品在液氮中研磨，加入2×CTAB（预热）和β-巯基乙醇，65℃水浴1～2h，每15分钟震荡1次。冷却至室温，12 000 r/min，离心20 min，取上清液，加入等体积的预冷氯仿-异戊醇（24 ∶ 1），抽提 10 min，12 000 r/min，离心 15 min，重复3次。取上清液，按上清液和异丙醇为1∶0.7的体积比例加入异丙醇，室温放置1 h，沉淀DNA。取沉淀物再用70%乙醇洗涤2次，风干后溶于TE（tris-EDTA buffer solution）缓冲液中-20℃保存。

中成药制剂时通常会添加大量的糖，多糖类辅料的添加以及深加工是影响DNA提取质量的重要因素，CATB法提取中成药DNA的优势在于能够很好地去除多糖，并且操作步骤简单。因此CTAB法为首选方案[18]。程春松等[19]使用中成药和保健品中常用的辅料（如淀粉、蔗糖、葡萄糖等）模拟CTAB法提取DNA过程，发现使用甲醇作为沉淀试剂优化传统的CTAB法，可以较好地克服中药制剂中淀粉对DNA提取的不利影响，可以有效地实现基于DNA的中药制剂分子鉴定。苟惠等[20]采用传统CTAB法、SDS法、磁珠法以及改良CTAB法对10种含当归的中成药进行DNA提取，发现利用改良CTAB法可获得纯度较高，质量较好的DNA。

2.2 SDS法

SDS属于阴离子去污剂，可使细胞膜和核膜破裂，并与核酸形成复合物。再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白质变性，通过离心可与蛋白质、多糖类等物质分开，最后加入乙醇，沉淀DNA[21-22]。SDS法常用的操作步骤，在样品中加入液氮研磨至粉末状，加入20% SDS裂解液，65 ℃保温，小幅度摇晃以充分混匀（不可强烈震荡以防DNA断裂），加入等体积的预冷氯仿-异戊醇（24∶1）抽提10 min，12 000 r/min，离心15 min，重复3次。取上清液，加入醋酸钾溶液（KAc，5 mol/L），充分混匀，冰上放置20～30 min，12 000 r/min，离心 20 min，取上清液，按上清液和异丙醇为1∶0.7的体积比例加入异丙醇，充分混匀，置于冰箱冷冻层沉淀30 min，12 000 r/min，离心10 min，即得DNA沉淀，风干，溶解于ddH2O或TE溶解中-20 ℃保存。

Coghlan等[23]采用SDS法对牙痛一粒丸等15种中成药中的原料药材进行了DNA提取，发现叶绿体片段trn L适用于这15种中成药中原料药材的基原鉴别。Cheng等[24]采用SDS法对不同厂家的六味地黄丸做了DNA分子提取，成功地鉴定出处方物种，并在部分样品中检测到处方外物质，如番泻叶、南瓜、芍药等。Coghlan等[25]采用SDS法对26种中药制剂进行DNA提取，均可获得相应的动植物特征DNA。

2.3 DNA试剂盒法

试剂盒是将组织分散成单个细胞，并使细胞膜与核膜破碎，释放出染色体，然后除去与DNA结合的蛋白质。DNA试剂盒法由试剂盒厂家提供，具体步骤按试剂盒的说明书进行操作。王丽丽[26]利用DNA提取试剂盒对启脾丸、人参健脾丸、人参归脾丸、蛇胆川贝胶囊4种含有名贵中药材的中成药进行DNA提取，在利用CA3吸附柱吸附DNA时，将3个重复富集到一个吸附柱上，提取DNA。Jia等[27]利用试剂盒法提取中药益母丸的DNA并对提取步骤进行了改良，获得了质量较高的DNA。Xin等[28]把《中华人民共和国药典》的DNA提取方法和试剂盒法结合起来进行了改良，成功提取中国传统中成药九味羌活丸的基因组DNA。石林春等[29]采用自动核酸提取仪和MagCore ®Genomic DNA Plant Kit提取方法对3份不同批次的如意金黄散提取基因组DNA，成功检测出除厚朴外的全部处方成分。

2.4 磁珠法试剂盒

磁珠法的原理是在特定的条件下，使用不同的细胞裂解液裂解细胞，让DNA分子游离出来。而磁珠表面有特定的官能团吸附核酸，带负电的DNA可以被吸附到磁珠表面，然后在外磁场的作用下，磁珠与裂解液分开。进而对磁珠进行目的物质的分离纯化，获得纯化核酸[30-31]。磁珠法中大多数都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤，每个步骤可由多种不同方法单独或者联合实现。田晓轩等[32]利用磁珠法动物基因组试剂盒抽提出中成药大黄蛰虫丸的DNA，并以16S rRNA、trn L、Mini-barcode为靶标进行荧光定量PCR，从23条克隆测序结果中解析到蛴螬、虻虫、甘草及桃仁或苦杏仁等中药成分。

2.5 乙醇沉淀法

乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na+之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。乙醇沉淀法的常用操作步骤：加入1/10体积的乙酸钠（3 mol/L，pH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol/L；加入2倍体积预冷的乙醇再次充分混匀置于-20℃中15～30 min；12 000 r/min，离心10 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；加入1/2离心管容量的70%乙醇，12 000 r/min，离心2 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；待室温下将开盖的EP管中残留的液体挥发；加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。Chen等[15]用经典CTAB法从固体样品（根粉、片剂和药丸）中提取基因组DNA，对液体样品（口服液和注射剂）进行乙醇沉淀。在口服液中未经纯化直接通过乙醇沉淀法提取的DNA是深棕色和黏稠的，大多数不能PCR扩增。纯化后的DNA显示正常的颜色和黏度，可以通过PCR有效的扩增。

3 展望

中成药DNA的提取是中成药分子生物学研究的基础，只有获取高质量的DNA才能更好地开展后续的研究[33]。近年来，虽然中药分子鉴定取得了快速发展，特别是2020年版《中华人民共和国药典》增订了聚合酶链式反应（PCR）法通则，进一步促进了中药分子鉴定技术的深入和普及[34-35]，然而对于中成药的分子鉴定研究报道相对较少，获取高质足量的DNA较为困难是其难以采用分子鉴定技术的重要原因。总之，中成药DNA的提取，需要根据中成药中不同的药材以及不同的制剂类型设计且优化相关的DNA提取方法。此外，经加工的肉类食品，血清和组织的DNA虽然降解都较为严重，但依然可以提取高质量的DNA。因此，除了上述提到的固体剂型的中成药多采用CTAB法、SDS法、磁珠法试剂盒，而液体剂型的多采用乙醇沉淀法外，将来中成药DNA的提取方法研究可以借鉴食品科学、法医及考古等学科，如硅柱离心法[36]、酚-氯仿法[37]、直接扩增法[30]。这些方法也将为中成药DNA提取提供参考。