口腔鳞状细胞癌相关环状RNA的表达及作用

房旭，阮强，刘维贤

（中国医科大学附属盛京医院 1.口腔颌面外科；2.病毒研究室，沈阳 110004）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常见的口腔颌面部恶性肿瘤，发病率逐年上升［1］。OSCC在确诊时常为中晚期或已经发生淋巴结转移，预后较差，5年生存率仅为50%［2］，因此，研究OSCC的发病机制和肿瘤标志物以及新型治疗干预手段十分必要。环状RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA家族的重要成员，约40年前首次发现于类病毒和RNA病毒［3-4］，随后HSU等［5］在真核细胞中也发现了circRNA。近年来，生物信息学和新一代RNA测序技术的迅速发展使circRNA成为非编码RNA家族新的研究热点［6］。研究发现，circRNA在OSCC组织中存在差异表达现象，提示circRNA在OSCC的发生、发展和侵袭等方面存在潜在的研究价值，并有望成为OSCC诊断和治疗的潜在靶标。

1 circRNA概况

1.1 circRNA产生机制

circRNA由前体信使mRNA衍生而来，主要包括外显子circRNA、内含子circRNA和外显子-内含子circRNA3种。circRNA的成环机制如下：（1）RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）调控的环化，即当外显子上的侧翼内含子与RBPs结合时，可以促进circRNA的形成［7］；（2）内含子配对驱动的环化，形成circRNA的前体序列中，外显子侧翼内含子中含有长反向互补序列，两侧内含子通过竞争配对介导circRNA的形成［8］；（3）套索驱动的环化，在pre-RNA转录过程中发生部分折叠，外显子随后出现跳跃现象，使被跨越的区域形成circRNA中间体，然后通过剪切形成circRNA［9］。除了上述circRNA，还有一种特殊类型的circRNA，即融合circRNA，研究［10］发现circRNA像蛋白基因一样也受到基因重排的影响而发生异常融合，这些异常融合的circRNA也会参与促进肿瘤的发生发展。

1.2 circRNA特点及功能

1.2.1 特点：（1）丰富性，circRNA广泛存在于植物、动物等多种生物中［11］；（2）稳定性，circRNA缺乏5’端和3’端结构，对RNA核酸外切酶的降解并不敏感，因此其半衰期是线性RNA的10倍［7］；（3）特异性，circRNA表达具有物种特异性［12］、组织特异性［13］、发育阶段特异性［14］及细胞特异性［15］；（4）保守性，circRNA具有高度保守的位点［16］，使疾病相关的circRNA干扰研究更加稳定。

1.2.2 功能：（1）miRNA海绵作用，circRNA中富含miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用［17］；（2）调控基因转录，EIciRNAs已被证明具有顺式调节功能［18］，circRNA还可与RNA聚合酶Ⅱ复合物作用，进而调节基因的转录［19］；（3）编码蛋白作用，研究［20］证明circRNA可模拟DNA的滚环扩增法，故可用于真核细胞的转译系统。

1.3 circRNA与肿瘤相关性

在恶性肿瘤中，circRNA差异表达可能影响信号转导、上皮细胞间充质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）、血管生成及细胞凋亡等多种生理过程。目前对于circRNA与恶性肿瘤相关性的研究主要有两大类，一类是通过高通量测序确定circRNA在癌症中的表达差异，从而寻找潜在的癌症诊断生物标志物，另一类是研究circRNA在癌症发生发展中的作用机制。

2 circRNA在OSCC中的作用机制

2.1 circRNA在OSCC中发挥miRNA海绵作用

目前，circRNA在肿瘤中的作用机制的研究大部分集中于竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说，ceRNA中含有miRNA的应答元件（microRNA response element，MRE），通过MRE竞争性结合miRNA调节基因表达和功能。circRNA可以通过“circRNAs-miRNAs-mRNAs”轴调控OSCC的发生发展。目前已经证实11种circRNA可在OSCC中充当miRNA的调节剂，其中5种circRNA在致癌过程中表达下调，充当肿瘤抑制因子，6种circRNA上调并充当致癌基因［22-33］。hsa_circRNA_100290可充当致癌基因，作为ceRNA调节miR-378a及其靶基因GLUT1的表达。GLUT1在OSCC中表达上调并参与OSCC的细胞糖酵解，从而调控细胞的迁移和侵袭，因此，hsa_circRNA_100290可能通过miR-378a上调GLUT1基因的表达，从而促进OSCC的糖酵解和细胞增殖［21］。hsa_circ_0002185也被称为circUHRF1，通过充当miR-526b-5p的海绵，正向调节c-Myc基因。circUHRF1在OSCC中表达下调，并抑制肿瘤的增殖、迁徙、侵袭和EMT，证实了circUHRF1在OSCC中的致癌作用。此外，c-Myc基因已被证实是OSCC中重要的致癌基因和转录因子，可促进转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和上皮剪接调节蛋 白1（epithelial splicing regulatory protein 1，ESRP1）mRNA的转录水平。ESRP1是参与EMT进程的一种剪接因子，已被确定为靶向的侧翼内含子，可促进circUHRF1的环化，因此，circUHRF1在EMT进程中构建了circUHRF1/miR-526b-5p/c-Myc/TGF-β1/ESRP1反馈环［22］，提示可以通过在侧翼内含子区域搜索互补序列来探索和预测潜在的新型circRNA。circ-PKD2在OSCC组织及细胞系中表达下调，充当抑癌因子，既促进OSCC细胞凋亡，又抑制OSCC细胞的增殖和侵袭。circ-PKD2通过抑制miR-204-3p的表达，调节miR-204-3p的潜在靶点——腺瘤性结肠息肉相关基因2（adenomatous polyposis coli 2，APC2）的表达水平。APC2下调可显著逆转circ-PKD2过表达对OSCC恶性进展的促进。以上结果表明circ-PKD2/miR-204-3p/APC2轴是参与OSCC发病机制的一条新途径，为OSCC的治疗靶点提供了新选择［23］。

2.2 circRNA在OSCC中与蛋白质结合起调节作用

circ-MMP9（hsa-circ-0001162）来源于基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），可调节OSCC患者组织中MMP-9的表达。研究发现，MMP-9在多种OSCC中均呈高表达［24］，并与OSCC的转移呈正相关［25］。XIA等［26］发现，circRNA_MMP9在OSCC中表达上调，可促进OSCC细胞增殖、迁移、侵袭，并抑制细胞凋亡，同时还证实了circ-MMP9可与AU富集元件结合因子1（AU-rich element binding factor1，AUF1）和miR-149相互作用，阻断AUF1和miR-149对MMP-9的抑制作用。AUF1是一种mRNA失稳剂［27］，circ-MMP9与AUF1的物理结合可增加MMP-9mRNA的稳定性，从而促进OSCC的转移。

2.3 circRNA在OSCC中可直接或间接调控信号转导通路

正常情况下，信号转导通路可以精准传导细胞外引起的各类信号刺激。传导系统中某一环节出现问题可导致基因表达发生异常改变，进而影响细胞的正常生物学功能，最终导致肿瘤的产生和转移。circRNA_102459的上调或circRNA_043621的下调可通过抑制MAPK和PI3K/Akt通路抑制OSCC的发生发展［28］。circ_0000140通过海绵化miR-31，释放大肿瘤抑制因子2，调节OSCC中的Hippo信号通路［32］。hsa_circ_0008309通过海绵化miR-136-5P和miR-382-5P调节ATXN1基因的水平，进一步调节Notch信号通路，介导肿瘤细胞迁移和侵袭［29-30］。由此可见，circRNA可以通过直接或间接调控信号转导通路的方式调控OSCC发生发展。

3 circRNA与OSCC诊断

1项meta分析汇总了19项具有肿瘤组织的circRNA以及配对的相邻非肿瘤组织的circRNA表达数据，其综合曲线下面积（area under curve，AUC）达0.79，综合灵敏度为0.72，综合特异度为0.74，提示circRNA具有癌症诊断生物标志物的价值［31］。WANG等［32］通过高通量测序对OSCC患者的癌组织及癌旁组织进行检测，获得了微阵列circRNA表达谱，发现circRNA分子在OSCC患者中有差异表达现象。多个课题组对OSCC患者的癌组织及癌旁组织的表达谱进行了对比分析，筛选出了一批差异显著的circRNA，如hsa_circRNA_102459［37］，hsa_circRNA_043621［37］，hsa_circ_0072387［33］，hsa_circ_001242［34］及hsa_circ_009755［35］等。LI等［36］采用qRT-PCR技术检测了55例OSCC样本中hsa_circ_0086414的表达量，发现hsa_circ_0086414在OSCC组织中的表达显著下调，并通过建立受试者工作特征曲线发现，hsa_circ_0086414可能是OSCC中必不可少的诊断生物标志物。除鉴别异常组织外，OSCC患者的唾液、外泌体和临床标准血液样本中均可检测出circRNA的差异，ZHAO等［37］研究证明，唾液hsa_circ_0001874与TNM分期（P=0.006）和肿瘤分级（P=0.023）有关，hsa_circ_0001971与TNM分期有关（P=0.019），表明唾液hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971作为诊断OSCC生物标志物的潜力。如果临床上能够通过患者的唾液或血液，在早期无创、快速和准确地诊断OSCC，无疑将极有助于改善患者的预后及5年生存率，因此，circRNA在诊断或预测疾病方面可能具有重要意义。

4 circRNA与OSCC的发生和发展

研究证实，致癌circRNA，如circDOCK1［29］、circ-HIPK3［26］、hsa_circ_0011946［38］，在OSCC组织中表达上调可促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡，反之则会降低OSCC细胞的活力，抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞的凋亡。相反，抑 癌circRNA，如circRNA_0000140［32］、hsa_circ_0002203［39］、hsa_circ_0063772［40］、hsa_circ_0004 491［41］、hsa_circ_0007059［42］、hsa_circ_0092125［43］、hsa_circ_0055538［44］，在OSCC细胞中呈低表达，若过表达这些抑癌circRNA，可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。细胞增殖调控是一个精准又复杂的过程，受包括凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及MMP9在内的多种信号因子的影响。其中，Bcl-2是一种抑制细胞凋亡的癌基因，Bax与Bcl-2有相互拮抗的作用，是细胞凋亡的促进基因，MMP-9是与肿瘤细胞的迁移和侵袭相关的蛋白酶。这些信号因子通过调节细胞周期发挥作用。研究［43］发现，过表达hsa_circ_0007059时，Bax上调而Bcl-2、MMP-9下调，抑制了OSCC细胞的恶性行为。研究［41］发现，过表达hsa_circ_0063772后，肿瘤细胞中Bcl-2表达水平明显降低，肿瘤细胞的增殖能力受到抑制，MMP-9蛋白的表达水平也降低，肿瘤细胞迁移、侵袭能力减弱。SU等［45］研究发现，hsa_circ_0055538通过p53信号通路调节Bax与Bcl-2的表达，并可能参与细胞周期的调节。另外，EMT过程在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用，使上皮细胞间失去细胞极性，肿瘤细胞间失去连接，致使肿瘤细胞的侵袭和转移能力显著增强。研究［42］显示，circRNA与EMT过程密切相关，hsa_circ_0004491沉默或过表达后，EMT相关蛋白的表达发生了显著变化，说明hsa_circ_0004491调节OSCC细胞中的EMT进展，并可能调控OSCC的发生发展过程。PENG等［31］发现，在circ_0000140过表达的OSCC组织中，EMT的相关蛋白E钙黏附蛋白增加，而N钙黏附蛋白减少，说明circ_0000140干扰了OSCC中的EMT表达。因此，circRNA可能通过参与细胞增殖和EMT过程调节肿瘤的发生发展过程。

5 circRNA与OSCC的治疗

circRNA可调节参与肿瘤发展基因的表达，若干扰circRNA在OSCC细胞中的表达，可有效抑制和逆转各种恶性生物学行为。文献［45］报道，hsa_circ_0005379通过调节抑制血管内皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）途径参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。EGFR的高表达与肿瘤的早期转移和不良预后存在密切关系。目前已开发出一系列针对EGFR的靶向疗法，其中，西妥昔单抗对EGFR具有高亲和力，可通过与EGFR特异性结合抑制肿瘤的侵袭和转移，具有良好的疗效，但却存在耐受性。hsa_circ_0005379的高表达可增加西妥昔单抗对EGRF的敏感性，为将来的OSCC抗癌药物设计提供了新的潜在目标。以上均为针对circRNA下游基因的治疗思路，由于circRNA的调控位于肿瘤发展的中央环节，也可通过调控其上游基因调节circRNA的作用。ZHANG等［46］研究发现，岩藻依聚糖可作为上游因子调控circFLNA的表达，二者均可介导与细胞生长、凋亡、迁移和侵袭有关的关键蛋白的表达。岩藻依聚糖还可通过提高Bax/Bcl-2的比率诱导细胞凋亡，并通过抑制MMP-9和MMP-2的表达来抑制OSCC细胞的迁移和侵袭。因此，认为岩藻依聚糖可能是治疗OSCC的潜在天然药物。

6 总结

circRNA作为RNA 领域的研究热点，其产生、结构、特点和生物学功能正在被逐步探索，为OSCC患者寻找合适的肿瘤筛查指标，从而实现对肿瘤早发现、早治疗，提高患者的治愈率和生存率。circRNA在肿瘤发生发展过程中起着重要的调控作用，能够参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等多种病理过程。由于circRNA在血液、唾液中广泛分布，因此，在OSCC早期诊断中作为生物标志物具有一定的潜能。如何运用circRNA的生物学功能治疗和诊断OSCC仍需要深入研究。

综上所述，circRNA在OSCC的诊断、治疗及预后中具有巨大的研究空间和应用潜力，期待未来能成为重要的生物标志物应用于临床中。