可视化核酸检测技术RPA-LFD 的研究和应用进展

于灵芝, 陶凌云,魏晓锋

(上海实验动物研究中心,上海201203)

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase ploymerase amplication， RPA） 是2006 年 由Piepenburg 等发明的一种新型恒温（37～42 ℃）核酸扩增技术［1］，既可以扩增DNA 也可以扩增RNA，省去了额外的cDNA合成步骤，整个过程进行得非常快，一般可在10 min内获得可检出水平的扩增产物［2］。与PCR 相比，整个过程不需要高温变性和低温退火，不依赖于精密的温控设备PCR仪。RPA对仪器的要求大大降低，反应时间明显缩短，简单、快速、高效，灵敏度高，特异性强，因此被认为是一种可以替代PCR的核酸检测技术［3］。

RPA扩增结果可以通过凝胶电泳、实时荧光和侧流层析试纸条等多种方法读取。RPA-LFD检测简单快速，设备便于携带，结果可肉眼判读，可以真正实现病原体快速现场核酸检测，为病原体监测和疾病防控提供了技术手段。但是，作为一项新的病原体检测技术，目前RPA-LFD尚未得到广泛研究。近年来，在人、畜、禽及水产动物上已有RPA-LFD 研究报告，而在实验动物病原体检测方面的研究较少。本文对RPALFD检测病毒、细菌和寄生虫等病原体核酸的研究现状进行综述，提示该方法对实验动物病原体能快速现场检测，从而在进行快速有效的实验动物质量监督中具有重要的应用前景，值得进一步推广。

1 RPA-LFD技术介绍

1.1 RPA-LFD的检测原理

RPA-LFD 是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记（三明治夹心法）、分子杂交和侧向流层析等方法相结合，且结果可视化的核酸检测技术。目前研究中使用最多的是英国TwistDX Inc公司设计的TwistAmp nfo 试剂盒（Nfo为核酸外切酶Ⅳ）。其检测原理如图1 所示。首先，上游引物和含有3’端生物素（biotin）标记的下游引物在重组酶和聚合酶的作用下进行扩增，含有羧基荧光素（FAM）标记的特异性探针与扩增产物进行扩增反应，形成5’端为FAM 标记，3’端为生物素标记的产物。将该产物加到侧向流动试纸条的样品孔中，通过毛细作用层析至结合垫（固定有标记抗FAM 抗体的胶体金颗粒），该产物中的5’端FAM 与抗FAM 抗体的胶体金颗粒结合形成复合物。该复合物层析到检测线（T线）时，因T 线固定有链霉亲和素（SA），含有生物素标记的扩增产物被链霉亲和素捕获显红色；没有被捕获的复合物继续向上层析至质控线（C 线）时，因C 线固定有特异性抗体，被特异性抗体捕获显红色。此时结果为阳性。该方法一般在5 min内便可通过肉眼读取检测结果［3］。

图1 重组酶聚合酶扩增技术-横向流动试纸条（RPA-LFD）的检测原理Figure 1 Detection principle of recombinase ploymerase amplication-lateral flow dipstick（RPA-LFD）

1.2 RPA-LFD的优点

RPA-LFD 不需要复杂的热循环，只需要简单的加热设备（如人体腋下夹持），37～42 ℃恒温10～30 min便可完成核酸扩增；之后将扩增产物滴在侧向层析试纸条上，大约5 min 后即可肉眼观测到结果。因此，该方法操作简单、快速，而且检测结果的特异度和灵敏度与qPCR 相当，不必依赖于实验室和精密仪器，无需专业人员，即可轻松实现病原体的现场快速检测。

1.3 RPA-LFD技术难点

目前，RPA-LFD 的一个重要技术瓶颈是其引物和探针既没有明确的设计原则，也没有专业的设计软件。英国TwistDX Inc 公司对RPA-LFD引物和探针的设计给出了简单的指导建议：RPA引物设计长度一般为35 bp，引物的5’末端应避免鸟嘌呤重复，GC 含量应控制在30%～70%；引物的3’末端的任何一个碱基错配都会严重影响RPA扩增效率，下游引物和探针序列之间叠加易形成二聚体，降低扩增效果。探针设计长度为46～52 bp，5’末端含有抗原标记（如FAM），3’末端含有聚合酶延伸封闭基团（如磷酸化基团）， 中部含有一个四氢呋喃基团（tetrahydrofuran，THF）；而且5’末端到THF 位点含有不少于30个碱基，3’末端到THF位点含有不少于15 个碱基，扩增时THF 可被Nfo酶切割，DNA聚合酶可以在该羧基端位点进行延伸，与生物素（biotin）标记的下游引物一起扩增出含有FAM和biotin双标记的扩增产物。

研究者通常需要手动设计不同的引物和探针。探针长度以及探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，这导致有很多种可能的组合，无疑会增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本。因此，应严格按照指导建议进行设计，高质量的引物和探针才可以使该方法的灵敏度和特异度得到保证［4］。随着RPA-LFD技术的广泛研究和应用，不久的将来必然会开发出一种软件来设计引物和探针，那么该技术的应用成本将大大降低。

另外，由于RPA-LFD 方法具有高效扩增的高灵敏度，在开管盖、取样、上样以及样本在侧向流动试纸条上层析的过程中，气体与样本液面摩擦可能产生核酸气溶胶污染，在下一次实验时容易出现假阳性结果。所以，RPA-LFD 检测应尽量在通风性好、空旷的环境条件下操作［5］。

1.4 RPA-LFD应用于现场核酸提取

现场分子诊断需要解决3 个关键问题，包括样品准备、扩增及检测，而样品准备是其中最大的挑战［6］。杨洋等［3］同时试验了cell-to-cDNA裂解液和基于磁珠的两种核酸提取方法。孙魁等［2］建立了碱裂解法结合纸基核酸纯化的样本处理体系，整个过程只需10～15 min。以上方法均摆脱了核酸提取过程中离心机的束缚，其与RPALFD 方法联用，可以使分子诊断中的样品准备、扩增和检测同时摆脱实验室束缚，使得RPALFD方法真正应用于临床样本的快速现场诊断。

2 RPA-LFD研究现状

RPA-LFD 方法由于操作方便、快速、高效，已在人类、畜禽及实验动物的病原体检测中进行了较多的研究。

2.1 RPA-LFD在人类和畜禽上的研究进展

2.1.1 用于病毒检测

Lau等［7］优化了一种快速检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2 （severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的反转录（reverse transcription，RT）-RPA-LFD 方法，RTRPA 在37 ℃恒温浴中反应20 min，在LFD 上反应5 min即肉眼可见结果。对78例阳性和35例阴性鼻咽标本进行敏感性和特异性分析，结果显示RT-RPA-LFD 和反转录定量PCR （reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）的检测限值分别为7.7和5.0拷贝/μL RNA，且均与其他病毒无交叉反应。RT-RPA 的临床敏感度和特异度分别为98%和100%。

Xiong 等［8-9］建立了检测登革热病毒（Dengue virus，DENV）的RT-RAA-LFD（RAA同RPA）方法。RT-RAA 在37 ℃恒温浴中反应20 min，扩增子在LFD 上反应3 min 即肉眼可见结果。RT-RAA-LFD方法的检测限值为10拷贝/μL RNA，特异度高。RT-RAA-LFD 与商业化的RTqPCR 相比，在247 例临床样本中检测一致性系数为0.957。

Gao 等［10］采用RPA-LFD 方法对猪德尔塔冠状病毒（porcine delta-coronavirus，PDCoV）进行了研究，PDCoV 在37 ℃扩增10 min，结果表明其检测限值为1×102拷贝/μL，灵敏度比普通PCR 高10 倍，且与猪的其他病毒无交叉反应，阳性检出率（26.47%）也比普通PCR（23.53%）高。

此外，研究者对流感A 和B 病毒［11］、卡萨奇病毒［12］、猪塞尼卡谷病毒［4］、非洲猪瘟［13］、鸡传染性喉气管炎病毒［14］、腺病毒［15］、新城疫病毒［16］、禽流感H9N2 及H7N9［17-18］、猫细小病毒［19］、南美蓝对虾浓核病毒［20］、鲤鱼水肿病 毒［21］和锦鲤疱疹病毒-3［21］进行了RPALFD 方法的研究，结果均显示RPA-LFD 方法检测快速，结果可靠，敏感度和特异度高，优于PCR方法，可用于现场快速诊断。

2.1.2 用于细菌检测

Peng 等［22］建立了检测类鼻疽伯克氏菌的RPA-LFD 方法，该方法能在30 min 内裸眼看到结果，最低检测限值达20 fg（约25.6 个拷贝），灵敏度与qPCR 相当，而且与其他类鼻疽菌群复合物无交叉扩增反应。

Zhao 等［23］建立了检测禽分枝杆菌副结核亚种的RPA-LFD 方法，在39 ℃扩增30 min 即可肉眼观察结果，最低检出限值是每个反应8 个拷贝，与PCR相当，且对其他5种分枝杆菌无交叉反应。与qPCR相比，RPA-LFD检测的敏感度为100%，特异度为97.63%。

此外，RPA-LFD 检测猪胞内劳森氏菌与普通PCR 结果的符合率为100%［24］。Gao 等［25］建立了检测贝类沙门氏菌的RPA-LFD 方法，在40 ℃只需扩增8 min就能达到检测阈值，每个反应（20 μL）可检测到100 fg DNA，其实际性能优于qPCR。

2.1.3 用于寄生虫检测

Sun等［5］建立了检测日本血吸虫SjR2基因的LFD-RPA 检测方法，在25～45 ℃条件下，反应15～20 min后可通过肉眼判定粪便样品的检测结果，最低检测限值为5 fg，这与qPCR 相同。与金标准Kato-Katz 法相比，LFD-RPA 检测的敏感度为92.68 %，特异度为100 %，一致性系数为0.947；而酶联免疫吸附法检测的敏感度为85.71 %，特异度为93.55 %，一致性系数为0.793；间接血凝试验的检测敏感度为78.57 %，特异度为83.87%，一致性系数为0.600。

此外，有学者建立了针对人恶性疟原虫［26］和犬吉氏巴贝斯虫［27］等的LFD-RPA检测方法，结果均表明该方法具有敏感、特异、快速的优势。

2.1.4 用于支原体检测

Zhao 等［28］用RPA-LFD 方法检测了442 个牛支原体样本，39 ℃扩增30 min 即可观察检测结果；同时与qPCR结果比较，RPA-LFD检测的灵敏度为99.00%，特异度为95.61%，一致性系数是0.902，最低检测限值为每个反应20个拷贝。

2.2 RPA-LFD在实验动物的研究进展

国家标准GB/T 14926［29］规定了实验动物微生物学检测方法，多采用培养法、酶联免疫吸附法、免疫荧光实验、血凝抑制实验等。北京和黑龙江等地方标准［30-32］进一步规定了实验用牛、实验用羊、实验用猪等实验动物的微生物学检测方法，包括抗原检测、抗体检测和核酸检测。上述标准中的方法检测时间少则数小时，多则数周；如果发现可疑结果，还需要重新检测，耗时耗力。近年来，实验动物团体标准［33-35］采用了荧光定量PCR方法对螺杆菌、肺支原体和小鼠肝炎病毒等一系列微生物进行检测，证明该方法快速、灵敏、特异，但需要专业技术人员、精密仪器和实验室操作环境。

对于国家标准和地方标准需要排除的微生物，包括口蹄疫病毒、山羊/绵羊痘病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、伪狂犬病病毒、多杀性巴氏杆菌和布鲁氏菌等，目前也有了一些应用RPALFD 检测的研究结果。例如，Wang 等［36-37］建立了检测口蹄疫病毒的RPA-LFD 方法，38 ℃扩增20 min 即可观察到结果；同时与qPCR 比较，该方法对质粒DNA的最低检测限值为每个反应3个拷贝，对病毒RNA 的最低检测限值为每个反应50 个拷贝，对其他气泡性病变的病毒无交叉反应。通过126例临床样本检测，发现RPA-LFD与qPCR 检测结果的一致性为98.41%。同时，通过对不一致阳性结果的分析发现，RPA-LFD 方法比qPCR更敏感。

Tu等［38］建立了检测山羊关节炎-脑炎病毒的RPA-LFD 方法，37 ℃、30 min 完成反应，最低检测限值为80 pg总DNA和10个拷贝质粒DNA，与羊痘和牛白血病等病毒无交叉反应。Yang等［39］建立了检测山羊/绵羊痘病毒的RPA-LFD方法，38 ℃下温浴20 min完成反应，与小反刍兽疫和口蹄疫等病毒无交叉反应。针对107例临床标本的评价结果表明，该方法能特异性检测羊组织和血液中的山羊/绵羊痘病毒，与实时qPCR对比无差异。

此外有研究发现，采用RPA-LFD 方法在39 ℃反应20 min可快速检测出伪狂犬病病毒［40］、布鲁氏菌［41］和多杀性巴氏杆菌［42］，经与实时定量PCR 方法或实时RPA 方法比较，以及临床样本验证，结果显示RPA-LFD 检测方法快速、灵敏、特异。

需要强调的是，本文介绍的RPA-LFD 检测方法不需要非常专业的人员，不依赖于实验室，可现场检测，30 min左右即可目测得到结果，这为实验动物微生物监测提供了一种快速、便携、灵敏和特异的替代工具，也为国家标准、地方标准和团体标准提供一种新的检测手段。

3 展望

近年来，RPA-LFD 技术作为一种快速的恒温核酸扩增技术，以其独特的优越性引起了研究者们的广泛重视。它同时满足以下所有快速分子诊断的标准：快速临床确诊，非实验人员操作，较低的检测成本，快速进行所有检测，可以接受的检测效果，以及与金标准相当或者更低的成本效率［43-44］。随着该技术的不断成熟和发展，RPA-LFD 可以真正实现便携式的快速核酸检测，这将对实验动物质量的监督检测，保证实验动物安全生产和使用具有非常重要的作用，从而有效避免动物疫病带来的重大经济损失。