核因子E2相关因子2与脑梗死的相关研究

吴飞跃 朱丹

生命体中，适量自由基与活性氧（ROS）、活性氮（RNS）物种在细胞信号传导中作为调节介质发挥着重要作用[1]。当产生和消除不平衡时可引起氧化应激，通过炎症、凋亡和细胞坏死、血脑屏障（BBB）破坏等机制导致重要生物分子和细胞损伤，参与脑血管疾病、神经系统变性疾病、癌症及衰老等病理过程的发生。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一种转录因子，通过结合并激活含有抗氧化反应元件（ARE）启动子的表达，参与机体的抗氧化过程，维持细胞稳态。

脑卒中是60岁以上人群第二常见死亡原因，其中缺血性卒中的占比最高，是永久性残疾的最常见原因[2]。急性卒中治疗的主要目的是挽救缺血半暗带。随着静脉溶栓治疗以及血管内血栓清除术的开展，急性缺血性卒中患者的治疗获得了显著成效。但由于溶栓治疗有限的治疗时间窗和潜在的副作用，少数患者能从中受益，因此需要研究新的治疗方法。缺血半暗带细胞死亡的几个关键因素已被确定，包括兴奋毒性、氧化和亚硝化应激以及炎症。Nrf2的激活是通过转录上调Ⅱ期防御酶和抗氧化应激蛋白，在细胞防御氧化应激中起关键作用。大脑保护自己免受有害刺激并从缺血性损伤中恢复的内源性防御机制是中风研究的一个关键目标[3]。本综述将讨论Nrf2-Keap1抗氧化反应元件转录途径在神经保护中的可能作用以及探讨这种途径的激活是否能保护大脑免受BBB破坏。近年来，相关药物的研究使Nrf2有望成为药理学靶点，现回顾总结Nrf2在生理和病理条件下的作用及相关药物的研究现状，探讨其与当前潜在治疗策略的相关性。

1 活性氧与氧化应激

自由基和ROS、RNS物种起着双重作用，在生物体内以可控的方式产生。作为细胞信号传导的重要组成部分，通过转录因子、代谢酶和膜通道等的激活或失活来调节多种细胞功能[4]。当产生和消除不能达到平衡时导致氧化损伤和组织功能障碍[5]。 RNS是一种能够破坏生物分子的强氧化剂，与ROS一样，RNS起着双重作用，它们对生命系统既可能有害，也可能有益[6]。ROS和RNS被复杂的抗氧化系统平衡，以维持细胞中的氧化还原稳态[5]。

2 Keap1-Nrf2-ARE通路的组成和作用

2.1 Nrf2Nrf2是细胞氧化还原稳态的主要调节因子，具有高度保守的碱性区亮氨酸拉链结构，是结合转录复合物的重要组成部分，控制一系列编码解毒酶和抗氧化蛋白基因的表达[6]。Nrf2靶基因由抗氧化酶、参与异生素解毒的蛋白质、参与修复及去除的蛋白质、炎症抑制因子以及其他转录因子的大网络组成[7]。与谷胱甘肽（GSH）的合成、利用和再生，NADPH以及血红素加氧酶-1（HO-1）的产生相关[5]，还介导细胞保护酶及蛋白质对亲电和氧化攻击的上调，成为细胞抗氧化的主要调节因子[4]。Nrf2蛋白包含605个氨基酸，形成6个功能域，命名为Neh1～6。Neh1为异二聚化结构域，Nrf2通过该结构域与其转录伴侣小Mafs相互作用，作为异二聚体结合到DNA上[8]。Neh2为Nrf2的负调控结构域。Neh3与染色体ATPase解旋酶DNA结合蛋白CHD6结合，作为转录辅激活因子促进抗氧化反应元件（ARE）依赖基因的转录。Neh4和Neh5结构域协同作用，结合另一个转录辅激活因子CBP。Neh6结构域控制非Keap1依赖性负调节[9]。在正常条件下Nrf2定位在细胞质中，与肌动蛋白结合蛋白Keap1相互作用，并被泛素-蛋白酶体途径快速降解。来自活性氧或亲电损伤的信号使Nrf2与Keap1解离，稳定的Nrf2转移到细胞核并反式激活其靶基因，进一步参与机体的抗氧化过程[10]。

2.2 Keap1Keap1是Nrf2的负调节因子，广泛表达并存在于细胞质中，是感知内源性氧化和亲电应激的中枢，在Nrf2的调节中起关键作用[11]。Keap1由624个氨基酸的蛋白质组成，包含3个主要结构域:BTB二聚化结构域、富含半胱氨酸的IVR结构域和C端Kech样结构域[9]。Keap1包含两个已知的蛋白质相互作用结构域:N末端区域的BTB结构域介导Keap1与Cullin3的结合，C末端区域的双甘氨酸重复序列（DGR）结构域介导Keap1与Nrf2 Neh2的结合，共同参与催化Neh2结构域赖氨酸残基上Nrf2蛋白的多泛素化[5]。Keap1与Nrf2的关联依赖于蛋白Keap1半胱氨酸残基的活性巯基。兴奋剂（如亲电试剂和氧化剂）可以修饰这些半胱氨酸残基，导致Nrf2从Keap1上解离。在基础条件下，Nrf2被二聚体Keap1/Cullin3复合物锚定在胞质溶胶中，Keap1通过直接结合到N端Neh2结构域来抑制Nrf2活性。Keap1与Neh2的相互作用导致Nrf2在细胞质中隔离，并通过蛋白酶体增强Nrf2的降解，从而对反应进行严格调节[5]。亲电物种水平的增加导致BTB和IVR结构域中半胱氨酸残基的共价修饰，并促使Cullin3解离和其他构象变化，使Nrf2从Keap1上解离，从而增加了Nrf2的稳定性，并进一步促进Nrf2转移到细胞核中。Nrf2与ARE序列在细胞核中结合，启动细胞保护基因的转录[8]。这些共价修饰Keap1半胱氨酸残基的几个亲电子小分子显示出临床前景[4]。

2.3 ARE保护基因的转录激活是由ARE的顺式作用元件介导的。Nrf2与ARE结合，该通路控制基因表达，该基因的蛋白质产物通过偶联反应和增强细胞抗氧化能力参与解毒和消除反应性氧化剂和亲电试剂，从而保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡[12]。ROS和亲电物质水平升高和/或抗氧化能力降低而导致的细胞氧化还原状态的改变与ARE介导的转录反应有关。除了参与诱导型基因表达，ARE还参与控制组成型基因表达，意味着增强子在应激和非应激条件下起维持细胞氧化还原稳态的关键作用[11]。

3 线粒体在氧化应激中的作用

3.1 Nrf2与线粒体的直接作用线粒体在生物合成和凋亡中起重要作用，还与其他ROS细胞间存在相互作用。Nrf2通过提供还原型谷胱甘肽（GSH）参与维持线粒体氧化还原稳态，此外还通过线粒体蛋白（如DJ-1、PGAM5和frataxin）对Nrf2活性进行调节。在Nrf2和线粒体之间形成了一个相互调节的环[6]。在对Nrf2敲除小鼠分离的线粒体的实验观察表明，Nrf2在维持线粒体膜完整性方面的作用可能涉及线粒体膜通透性的转变。Nrf2敲除细胞表现出自发凋亡增加，对化学诱导的线粒体损伤高度敏感，而化学保护剂激活Nrf2可防止线粒体损 伤[5]。Nrf2的过表达阻止H2O2诱导的线粒体网络的破坏、线粒体膜电位的丧失。Nrf2定位于线粒体外膜表明Nrf2与线粒体组分直接相互作用以保持线粒体的完整性和功能。研究表明Nrf2与线粒体调节呈正相关，Nrf2线粒体保护激活剂的开发有望保护神经元细胞免受氧化损伤和神经变性[11]。

3.2 Nrf2影响干细胞的功能Nrf2也影响干细胞的线粒体功能，对干细胞自我更新、存活有影响。Nrf2活性状态影响线粒体生理学包括生物发生、脂肪酸氧化、呼吸、ATP产生、氧化还原稳态以及结构完整性和动力学[13]。许多人类病理状态和衰老与线粒体功能障碍有关的同时也被证实与抑制的Nrf2信号相关。干细胞内的细胞氧化还原平衡可调节细胞再生的过程。当暴露于氧化应激时，Nrf2敲除干细胞的自发凋亡率增加，存活率降低。表明Nrf2在造血和干细胞存活中起关键作用[6]。

4 Nrf2与BBB的保护作用

BBB能选择性限制血源性和外源性物质进入中枢神经系统，从而保持大脑稳态[14]。其完整性是由氧化应激调节的[15]。脑血管内皮非常容易受到氧化应激的影响。Nrf2能表达一种调节内皮功能的氧化还原敏感转录因子，在调节紧密连接完整性和维持BBB功能中起着潜在作用。Nrf2缺失或下调导致应激水平的增加将对紧密连接和粘附连接蛋白的表达产生负面影响，细胞间紧密连接复合物的组成改变是潜在的机制之一，这种机制可能损害BBB功能，并导致内皮屏障阻力降低，进而导致BBB功能障碍。Nrf2信号的持续激活可能有预防低血糖诱导的脑血管功能障碍的潜力，通过戊糖磷酸途径重新引导代谢流量，从而对细胞生物能学和新陈代谢起到关键的调节作用。BBB内皮独特的结构和功能表型需要高能量，具有丰富的葡萄糖转运蛋白和线粒体，Nrf2介导的葡萄糖摄取调节可能对BBB的功能和完整性至关重要。BBB的完整性对确保最佳的中枢神经系统功能至关重要，其在脑血管病理过程中的破坏可能是主要神经系统疾病发生和进展的先兆[16]。

5 Nrf2相关药物的治疗进展

5.1 Nrf2相关临床前药物的治疗进展近年来，多种植物提取物被证明与Nrf2防御途径的激活相关：①獐牙菜苦苷（Swe）是从秦艽中分离得到的一种活性裂环烯醚萜苷类化合物。实验研究证明Swe预处理促进了Keap1-Nrf2复合物的Nrf2核易位，并增强了NAD（P）H:醌氧化还原酶-1（NQO1）和HO-1在体内外的表达，被认为是通过激活Nrf2途径保护脑缺血再灌注损伤有前途的保护剂[17]。②根皮素属于类黄酮家族，在苹果和苹果衍生产品中含量高。大量证据表明根皮素具有抗氧化特性，其机制与氧化应激抑制和Nrf2防御途径激活有关。根皮素预处理后Nrf2表达显著增加，上调缺血/再灌注脑组织中Nrf2 mRNA和蛋白的表达，显著抑制了氧化应激过程[18]。这表明根皮素有利于治疗与氧化应激相关的缺血性卒中。③青藤碱作为一种从青藤茎和根中分离出来的生物碱，具有抗炎和免疫调节等广泛作用。通过泛素化蛋白酶体介导的Keap1降解激活Nrf2信号通路[19]。青藤碱不仅被发现通过调节离子通道对缺血性脑损伤发挥保护作用，还发现通过抑制小胶质细胞对脑出血诱导的脑损伤起保护作用。实验证明青藤碱可在中枢神经系统组织中获得，可通过BBB[17]。因此认为青藤碱具有治疗中枢神经系统疾病的巨大潜力。

5.2 Nrf2相关临床药物的治疗进展此外，许多临床药物也显示出较好的治疗前景。研究发现丹红注射液可以提高抗氧化酶SOD 和GPX 的表达水平，可以通过调控Nrf2信号通路改善干细胞移植微环境，增加移植干细胞的存活率[20]。另外，也有研究证明在缺血纹状体和皮质中，人参或富马酸二甲酯（DMF）预处理以Nrf2依赖的方式减轻星形胶质细胞和小胶质细胞反应性胶质增生，并通过Nrf2依赖机制对缺血性脑损伤产生持久的神经保护作用[21]。 五味子提取物被证明可以显著上调Nrf2，促进Nrf2从细胞质向细胞核的移位，还可抑制Keap1的表达，并显著增加Nrf2的稳定性。敲除Nrf2可减弱五味子提取物对这些药物代谢酶和药物转运蛋白的调节作用[22]。此外，李艳红等[23]发现腺苷蛋氨酸联合糖皮质激素可通过激活Nrf2/Ho-1通路发挥抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用， 从而减轻细胞损伤。实验数据显示血栓通注射液可通过激活Nrf2-VEGF通路显著增加了Nrf2、HO-1和NQO1的表达，促进血管生成，可明显改善神经元功能缺损[24]。研究还发现三七总皂苷和人参皂甙Rb1通过激活Nrf2，抑制p38-VCAM-1信号通路可以促进Nrf2蛋白的核易位，从而抑制血管粘附事件[25]。体外实验数据证实，银杏内酯通过激活Akt/Nrf2通路可显著降低ROS水平，提高SOD活性和HO-1和NQO1蛋白水平。在体内可显著降低大脑中动脉闭塞大鼠模型的梗死体积比，且呈剂量依赖性，还显著上调HO-1、NQO1、SOD、p-Akt、p-Nrf2和Nrf2的蛋白水平，显著抑制脑缺血再灌注引起的氧化应激损伤[26]。越来越多药物不断显示出神经保护作用，对该类药物内源性保护机制的不断深入研究可为神经系统疾病的治疗提供新的途径。

6 小结

Nrf2是抗氧化的主要调节剂，Nrf2抗氧化特性对多种疾病表现出多重保护作用，为药物的开发开辟了新途径。然而，基于目前对急性脑梗死损伤和修复过程的认识不完善，需要进一步的研究来建立“治疗窗”，以明确Nrf2的激活在脑卒中发作前后如何提供脑保护。了解Nrf2介导的氧化还原信号的分子机制，可以为神经保护的潜在治疗提供依据。BBB损伤是缺血性脑损伤的一个关键病理过程，也是重症脑卒中和溶栓治疗诱发出血的潜在因素。因此，保护BBB是一个重要的治疗靶点，它不仅可以降低溶栓过程中的出血风险，还可以改善重症脑卒中的预后。进一步了解Nrf2在卒中发生后BBB保护中的具体作用及相关机制将为探索缺血性卒中的有效和安全的治疗方法提供思路。