miRNA对多发性硬化CD4+T淋巴细胞分化调控机制的研究进展

罗春芳 唐玉兰

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种由免疫介导的中枢神经系统(central nervous system)自身免疫性疾病，以脱髓鞘、神经功能紊乱和进行性神经变性为特征。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS理想的动物模型。在MS中，自身反应性T淋巴细胞穿过血脑屏障进入中枢神经系统，引发炎症级联反应，导致中枢神经系统脱髓鞘和斑块形成，进而导致神经功能障碍[1]。大量研究证明CD4+T细胞在MS发病机制中发挥重要作用，辅助性T细胞1(helper T cell，Th1)和Th17细胞参与了MS的发病过程，在EAE模型中调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)和细胞因子白介素10(interleukin 10，IL-10)是疾病发展的两个重要负性调控因子，另外，Th2细胞的增多或Th1/Th17细胞的抑制可延缓EAE的进展[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调控活性的内源性非编码小RNA，它参与多种生物体内生理进程的转录后调控[2]。miRNA合成过程中需要Drosha和Dicer核酸酶，这两种酶的特异性缺失会导致T细胞的发育、分化和细胞因子的产生出现异常，这提示miRNA可能对T细胞的发育和分化起着重要作用[3]。近年来，越来越多的动物研究表明，miRNA作为免疫应答和炎症调控等不同生物学过程的关键调控因子，在MS发病机制中发挥重要作用。本文对MS和EAE免疫应答过程中CD4+T细胞的分类和作用进行综述，重点阐述miRNA对CD4+T细胞分化和功能的调节作用。

1 CD4+T细胞亚群分类、基本作用及特点

CD4+T细胞在病原体的防御和维持免疫稳态方面起着至关重要的作用。在抗原刺激下，初始CD4+T细胞被激活，增殖分化为各种Th效应细胞，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg等。Th细胞亚群是引导免疫反应的关键因素，在适应性免疫应答中发挥重要作用。Th1细胞主要分泌干扰素-γ(interferon γ，IFN-γ)介导细胞免疫应答，在保护宿主免受特殊细胞内病原体侵袭方面起着重要作用，Th1细胞过度活跃会导致组织损伤，引发不必要的炎症性疾病和自身反应性疾病；Th2细胞主要分泌IL-4介导体液免疫应答，在抵抗细胞外病原体方面很重要；Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22等促炎因子，在诱导自身免疫和增殖中起关键作用；Treg细胞具有免疫抑制特性，主要分泌IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)，可通过细胞间相互作用抑制其他细胞亚群的激活，抑制免疫应答，维持自身免疫耐受和免疫稳态。

2 CD4+T细胞亚群在MS病程中的作用

目前普遍认为，CD4+T细胞协同其他免疫效应因子共同在MS的发病机制中发挥重要作用，它们以中枢神经系统髓鞘中的抗原为靶点，是MS炎症的最初驱动因素。自身反应性T淋巴细胞在外周免疫系统活化增多，透过被破坏的血脑屏障进入中枢神经系统中，导致大量炎性细胞浸润引发慢性炎症，释放炎性细胞因子和毒素导致中枢神经系统髓鞘脱失和轴突变性，引起神经传导缺陷，此过程是MS临床症状的基础，在MS的发病过程中起着决定性作用[4]。由CD4+T细胞分化而来的Th细胞亚群和Th细胞分泌的细胞因子之间的平衡作用影响着MS的发生发展，Th1/Th17细胞扩增或Th2/Treg细胞减少都可能诱导MS的发病；疾病的发生发展还涉及信号传导途径调节机制，如IFN-γ、IL-4和IL-12等细胞因子可通过调节激酶/信号转导及转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路来控制Th1/Th2细胞的分化，进而调控免疫应答[5]。

Th1细胞是最早被发现在MS中具有致病性的细胞亚群，由初始CD4+T细胞在IL-12和IFN-γ的刺激下分化而来。信号转导子和转录激活子4(signal transducer and activation of transcription 4，STAT4)和STAT1对Th1的分化极其重要，IL-2激活STAT4转录信号，IFN-γ则激活STAT1转录信号，在强T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号存在的情况下，IL-12/STAT4和IFN-γ/STAT1信号传导途径可诱导Th1特异性转录因子T细胞表达的T盒(T-box expressed in T cells，T-bet)使T-bet表达上调，进而放大IFN-γ/STAT1/T-bet信号，促进Th1细胞分化；而STAT5则直接增强IFN-γ的表达来促进Th1分化，导致IFN-γ分泌进一步增加[6]；而IFN-γ可调控中性粒细胞向中枢神经系统募集，通过产生活性氧物质破坏血脑屏障，促进MS的发展[7]。缺乏Th1型相关因子T-bet和STAT4的小鼠对EAE的发生具有抵抗力，而IFN-γ-/-、IFN-γR-/-和STAT1-/-型小鼠则加重EAE的症状[6]，这提示Th1细胞可通过不同的机制在EAE的发病过程中发挥作用。

Th2细胞主要分泌IL-4，同时IL-4也能刺激初始CD4+T细胞分化为Th2细胞，而Th2细胞的分化依赖于转录因子γ-氨基酸结合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)和STAT6。产生IL-4的Th2细胞增加或者细胞从Th1型向Th2型免疫应答的转移对Th1细胞具有拮抗作用，从而认为Th2细胞具有抗炎作用。但也有研究表明Th2细胞可引起临床表现较为温和的非典型EAE[8]。

Th17细胞由初始CD4+T细胞在IL-6或IL-21与TGF-β刺激下分化而来，Th17细胞能分泌一系列细胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，这些细胞因子可以招募和激活中性粒细胞和巨噬细胞，促进炎症[9]。Th17细胞以表达转录因子维甲酸受体相关孤核受体α(retinoicacid-related orphan receptorα，ROR-α)、维甲酸受体相关孤核受体γt(retinoicacid-related orphan receptor γt，ROR-γt)和STAT3为特征，主要参与炎性疾病的介导，在MS中具有致炎作用。

Treg是初始CD4+T细胞在TGF-β刺激下分化而来的另一重要亚群，CD4+Treg包括多种类型，根据成熟部位的不同，CD4+Treg至少有两种类型：胸腺自然产生的CD4+CD25+Treg(nTreg)及外周诱导产生的Treg(iTreg)。nTreg主要通过细胞接触依赖性的方式抑制炎症和免疫反应，iTreg则通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-β发挥免疫抑制作用[9]。另外，按表型和作用机制的不同，CD4+Treg还包括Ⅰ型调节性T细胞(regulatory cell type 1，Tr1)、Ⅲ型辅助性T细胞(helpertype 3，Th3)和IL-10+/TGF-β+CD4+Treg细胞等类型。MS中的Treg异常可能包括数量的减少、抑制能力的丧失以及向中枢神经系统迁移能力的缺陷，许多MS患者Treg中FoxP3表达降低，Treg抑制功能降低[10]。有研究表明，增加EAE小鼠体内Treg的数量，可以抑制小鼠自身反应性T细胞向中枢神经系统的迁移和浸润，显著改善MOG诱导的EAE症状[11]。

3 miRNA调控CD4+T细胞分化

CD4+T细胞作为MS发病机制中的关键细胞，其分化机制一直是研究者们的关注点。已有大量研究证实miRNA可通过对某些特定基因发挥靶向作用，调控CD4+T细胞的分化和功能，参与Th细胞亚群的发育过程，同时调控多种信号通路，在MS和EAE的发病机制中发挥重要作用。

3.1 对Th1/Th2细胞分化的调控大量研究发现MS中多种miRNA参与了Th1/Th2细胞的分化和功能，对于疾病的发生发展非常重要。现有研究发现，与健康对照组相比，MS患者幼稚CD4+T细胞中miR-128、miR-27b表达升高，MS患者记忆性CD4+T细胞中miR-340表达增加，其中miR-128和miR-27b能够直接与B淋巴瘤Mo-MLV插入区1同源物(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog，BMI1)和GATA3的mRNA相互作用并抑制两者表达，miR-128还可抑制IL-4的表达；miR-340则与BMI1和IL-4的mRNA结合并抑制BMI1和IL-4表达，而抑制BMI1和IL-4的表达可使免疫应答反应平衡从Th2向Th1方向转变，进而驱动MS的发病[12]。

Guan等[8]发现在EAE小鼠CD4+T细胞和中枢神经系统的浸润单核细胞中致死因子7(lethal-7，let-7e)表达明显上调，还发现let-7e能够直接与IL-10和IL-13特异性结合，抑制两者在血浆中的产生进而增强Th1的分化，加重EAE症状。体外沉默Let-7e可以抑制脑源性Th1，而使Th2细胞增加，EAE症状减弱；进一步用慢病毒载体转染小鼠使let-7e过表达，结果发现Th1细胞分化增强，IFN-γ生成增加，EAE症状加重[8]。这些现象表明let-7e通过调控Th1和Th2细胞的分化参与EAE的发生发展。

miR-140-5p首先在软骨细胞中被发现，与软骨变性和骨化有关。Guan等[1]研究发现miR-140-5p在MS患者CD4+T细胞中表达水平明显下调。该研究发现MS早期miR-140-5p的表达开始下降，随着疾病的发展达到高峰，miR-140-5p的表达继续下降；在MS缓解后，miR-140-5p的表达逐渐恢复到原来的水平，提示miR-140-5p的表达与MS的进展呈负相关。荧光素酶检测发现miR-140-5p通过靶向STAT1，抑制STAT1的功能和表达，进一步抑制下游靶点T-bet的表达和激活，进而抑制Th1细胞的分化，降低IFN-γ的表达[1]。此外，有报道称miR-140-5p还可通过线粒体呼吸途径抑制Th1细胞的分化[5]。

研究表明miR-142a-5p可通过靶向作用于细胞因子信号传导抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)促进Th1细胞分化。当SOCS1缺失时，CD4+T细胞主要分化为Th1细胞。Talebi等[13]发现在MS患者脑组织和EAE小鼠脊髓中miR-142a-5p表达水平升高，而SOCS1表达降低；荧光素酶检测显示miR-142a-5p能够直接靶向SOCS1进行转录调控，促使初始CD4+T细胞明显向Th1细胞方向分化。

3.2 对Th17细胞分化的调控Th17细胞在MS/EAE的发生发展中发挥重要作用，已有大量体内和(或)体外研究发现许多miRNA介导Th17的分化，参与MS/EAE的发生发展。本文分别从促进分化和抑制分化两方面来阐述miRNA对Th17细胞的调控作用。

3.2.1促进Th17细胞分化：Du等[14]发现miR-326是Th17细胞相关miRNA，与健康对照组和缓解期MS患者相比，miR-326的表达在复发期MS患者CD4+T细胞中明显升高，提示mi-326与MS疾病严重性相关。在EAE模型中发现miR-326通过靶向Th17细胞分化的负调控因子E26靶向因子-1(E26 transformation-specific-1，Ets-1)抑制Ets-1的合成，进而促进Th17细胞的分化，导致EAE病情加重。另外，miR-155也可以通过靶向抑制Ets-1促进Th17细胞的分化，加重EAE病情[15]。Zhang等[16]发现在EAE中miR-155的表达明显上调并与疾病的严重性成正相关，EAE小鼠中miR-155过表达可导致Th1和Th17细胞比例升高，IL-17和IFN-γ产生增多，表明miR-155可能通过促进Th1和Th17细胞的分化加重EAE的病情；用miR-155抑制剂治疗的小鼠EAE病程延迟、疾病严重程度降低并且中枢神经系统中的炎症浸润也减少，这提示miR-155可能是治疗MS/EAE的一个有效治疗靶点。

STAT3作为Th17细胞的关键转录因子对Th17的分化十分重要。miR-301a在MS的CD4+T细胞中过表达，并通过靶向活化的STAT3蛋白抑制物(protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3)的mRNA抑制STAT3信号转导，进而促进Th17细胞的分化[17]。let-7f-5p在MS患者的外周血CD4+T细胞和Th17细胞分化过程中表达明显降低，与let-7f-5p表达降低相反，STAT3和磷酸化的STAT3蛋白水平显著升高，且与let-7f-5p表达水平呈负相关；另外，研究还发现STAT3是let-7f-5p的直接靶点，let-7f-5p过表达可抑制Th17的分化，在MS中let-7f-5p通过表达下调促进Th17细胞的分化而参与MS的发展[18]。磷脂酰肌醇3-激酶-苏氨酸激酶-哺乳动物雷帕霉素靶点(phosphatidyl inositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR)轴是监管Th17分化的主要功能轴，能加强STAT3磷酸化，促进RORγt 转录。miR-17和miR-19b是miR-17-92基因簇负责促进Th17分化的两个miRNA。miR-19b可抑制磷酸酶和张力蛋白同源性基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的表达，促进PI3K-AKT-mTOR轴的激活，进而促进非致病性Th17细胞的分化。Ikaros家族锌指4(Ikaros family zinc finger 4，IKZF4)能负向调控Th17细胞分化，而miR-17还可通过抑制IKZF4表达促进致病性Th17细胞的分化[19]。

Smad信号通路与Th17细胞分化密切相关。miR-181c在EAE小鼠CD4+T细胞中高表达，其表达与疾病的严重程度呈正相关。miR-181c与Smad7靶向结合，抑制Smad7表达，解除Smad7对TGF-β介导的Smad信号通路的抑制作用，进而增强Smad信号通路，激活对IL-2自分泌的抑制作用，促进Th17细胞的分化；敲低小鼠miR-181c的表达可抑制中枢神经系统内的炎性细胞浸润和髓鞘脱失，减轻EAE症状和延缓疾病进展，这表明miR-181c通过促进Th17的分化参与EAE的发生发展[20]。此外，miR-21在EAE小鼠Th17细胞中的表达升高，也通过靶向Smad7抑制Smad7表达，进而促进Th17细胞的分化[21]。

miR-590也与Th17细胞分化密切相关，它首先在肿瘤领域中被发现。miR-590的靶向因子Tob1是tob/btg1抗增殖蛋白家族的成员，在肿瘤发展中起着至关重要的抑制作用。最近研究表明miR-590在MS患者Th17细胞中的表达明显上调，并且其表达与Tob1呈负相关，还发现miR-590可直接作用于Tob1基因并抑制其表达来促进致病性Th17细胞分化，进而增强中枢神经系统的炎症反应，导致MS病情加重；另外，miR-590的过表达还可通过上调如CXCL3、CSF2和IL-23R等炎症相关分子增加Th17细胞的致病性[22]。

3.2.2抑制Th17细胞分化：Zhu等[23]发现在EAE小鼠CD4+T细胞和Th17细胞中miR-20b的表达明显下调，而在Th1、Th2、iTreg细胞则上调；该研究还发现ROR-γt和STAT3都是miR-20b的潜在靶点，用慢病毒载体转染小鼠使miR-20b过表达，可使ROR-γt和STAT3表达下降，进而抑制Th17细胞分化，减轻EAE症状，这表明miR-20b通过靶向抑制ROR-γt和STAT3表达，进而抑制Th17分化而缓解EAE进程。另外，有研究发现miR-30a靶向作用于IL-21受体也可抑制致病性Th17细胞的分化，减轻EAE的严重程度[24]；而miR-26a则通过靶向IL-6抑制Th17细胞功能并加强Treg细胞功能，进而减轻EAE病情[25]。

miR-146a现已被确认为减少炎症基因表达的关键调节因子，研究表明miR-146a通过靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关分子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)和白细胞介素1受体相关激酶1(interleukin 1 receptor associated kinase 1，IRAK1)的表达，进而下调自身反应性CD4+T细胞中核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)的活性，阻断T细胞自分泌IL-6/IL-21-Th17分化途径，抑制致病性Th17细胞的分化[26]。Liu等[27]研究发现miR-15b在EAE小鼠和MS患者的CD4+T细胞中表达明显下调。通过动物实验研究还发现，miR-15b通过靶向O连接N乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linkedN-acetylglucosamine transferase，OGT)来抑制Th17细胞的分化，还通过降低NF-κB转录因子家族成员c-Rel和p65的O-GlcN酰化，抑制ROR-γt的转录激活，进而抑制Th17细胞的分化；miR-15b过表达可减轻EAE的症状，而敲除miR-15b可使EAE症状加重。

3.3 对Treg细胞的调控Treg也是CD4+T细胞的重要亚群，miRNA在调节Treg的活化、分化、抑制功能以及稳定性方面发挥着关键作用。Dolati等[28]报道 miR-142-3P直接靶向作用于腺苷酸环化酶 9(adenylate cyclase 9，AC9)的 mRNA使细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)维持于低水平。高水平的cAMP可增强Treg细胞的抑制功能，miR-142-3P表达可被Foxp3抑制，导致cAMP生成增加进而增强Treg细胞的抑制功能。研究表明miR-146a在EAE小鼠的Treg中高表达，对Treg的抑制作用至关重要，miR-146a缺乏导致Treg细胞数量增加，但功能受损，从而导致大量淋巴细胞活化和组织浸润，以及免疫耐受性的破坏，表现为多个器官中致命的IFN-γ依赖性免疫介导的损伤[29]。miR-155在EAE小鼠的Treg中表达明显增加，miR-155敲除小鼠Treg数量减少，但Treg抑制功能不受影响；进一步研究证明miR-155通过靶向作用于SOCS1促进Treg的增殖和存活，从而提高细胞对其主要生长因子的敏感性，对Treg的发育和谱系稳定性具有重要作用[30]。

有研究显示，在miR-125a敲除鼠中，Treg的分化出现了明显障碍，与对照组相比，miR-125a敲除型EAE小鼠表现出的症状明显严重，而注射了miR-125a模拟物的EAE小鼠，其发病程度明显减轻；这些表明miR-125a在调节Treg细胞谱系的分化和维持免疫稳态方面起着关键的调控作用[31]。NF-κB转录因子家族成员c-Rel对胸腺细胞发育至关重要，对Treg的分化和体内平衡也非常关键，在胸腺细胞发育过程中，miR-27的过表达通过抑制c-Rel极大地减少Treg的产生，其既损害了胸腺Treg的发育，也损害了外周Treg的稳态[28]。

Smad7是转化生长因子βⅠ型受体(TGF-βreceptortype Ⅰ，TGFβR Ⅰ)信号通路的负调控因子，它可以驱动Th1细胞介导的免疫应答而抑制Treg细胞。研究表明miR-181a和miR-181b在EAE和MS患者中的表达显著降低，与miR-181相反，Smad7表达则升高；通过动物实验还发现miR-181a和miR-181b可直接抑制Smad7表达而促进Treg细胞分化[32]。

综上，近年来许多研究发现miRNA通过作用于某些特异性调节因子参与不同信号传导途径，调控CD4+T细胞亚群的分化和功能，进而影响MS/EAE的发病以及疾病严重性，这提示miRNA可能为MS的诊断和治疗提供新帮助，但miRNA具有靶向多样性，在这些调控过程中的具体作用机制尚未完全清楚，仍需进一步探讨。