表观调控蛋白BRD4及其抑制剂在心肌纤维化中的研究进展

焦浩淼，崔 静，高 歌，赵 文

郑州大学药学院/药物研究院；教育部药物关键制备技术重点实验室 郑州 450001

心肌纤维化是许多心血管疾病的早期改变，如高血压、心肌梗死、病毒性心肌炎、动脉粥样硬化、糖尿病等[1]；心肌纤维化可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等严重并发症，因此预防和逆转心肌纤维化是临床治疗中的关键点之一。已有研究[2]表明表观遗传学参与调控炎症、免疫反应以及与心血管并发症有关的基因的转录。BRD4是表观调控蛋白BET家族的一员，其作用底物广泛，可与多种蛋白相互作用，参与细胞的增殖、凋亡、炎症反应等生物过程，因此BRD4与许多疾病的发生和发展密切相关[3]。尽管纤维化对心功能的影响已被广泛接受，但目前还没有针对性的抗心肌纤维化药物。因此，对驱动心肌纤维化基本机制的深入了解，促进心肌纤维化新型疗法的发展以及为研发治疗心肌纤维化的药物提供新的治疗靶点具有重要意义。本文对最近几年的研究进行总结，对心肌纤维化和表观调控蛋白BRD4之间的潜在关系，以及它在控制纤维化前基因表达中的关键作用、靶向BRD4的小分子抑制剂在心血管疾病治疗中的潜力进行综述。

1 心肌纤维化

1.1心肌纤维化的病理学特征纤维化是由组织损伤或应激引起的一种典型的伤口愈合反应。在正常情况下，心肌纤维化是一种修复过程的结果，这种修复在心肌细胞损伤时被激活。大量心肌细胞的死亡将会激活修复程序，进而激活下游炎症-纤维信号通路，导致纤维组织的形成[4]。例如，在急性心肌梗死中，大量心肌细胞的突然死亡会引发强烈的炎症反应，最终导致以胶原性瘢痕代替死亡的心肌细胞，同时纤维瘢痕通过维护心室结构的完整性和防止扩张性重塑来保护心脏、防止破裂。虽然纤维化反应有助于稳定心肌损伤的局部区域，但过度的、弥漫性或慢性纤维化长期作用可能对心功能有不利影响[5]。

成纤维细胞起源于间充质细胞，分布于结缔组织。鉴于成纤维细胞涉及“纤维化”的组织重塑，因此是与心脏疾病最显著相关的细胞类型。在损伤部位，成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，活化的肌成纤维细胞是心脏纤维化中纤维蛋白的主要来源，推动纤维化的进程[6]。肌成纤维细胞在长期负荷、炎症、感染、代谢失衡和恶性肿瘤条件下被激活，进而引起细胞外基质出现纤维特性[7]，例如纤维胶原逐渐沉积，胶原分泌比例失调。多余胶原蛋白增加了心肌壁的硬度，并参与心室重构，从而阻碍心肌正常的收缩和舒张功能。

1.2心肌纤维化涉及的分子途径

1.2.1 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和醛固酮是RAAS的主要效应因子，它们通过不同的作用机制参与心肌纤维化的发生。巨噬细胞和成纤维细胞浸润损伤的心脏，产生肾素和血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，这些分子是生成AngⅡ所必需的[8]。在致心肌纤维化过程中，AngⅡ主要通过激活其Ⅰ型受体(AT-Ⅰ)促使多种分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的激活[9]，进而诱导心肌细胞肥大、心肌成纤维细胞增殖、基质内胶原沉积。AngⅡ在促进胶原合成的同时，还能够抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，影响胶原的降解。

1.2.2 转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β) 在哺乳动物中，TGF-β有3种亚型(TGF-β1、2和3)，由3个不同的基因编码。尽管这3种TGF-β亚型通过相同的细胞表面受体发出信号并作用于相同的靶标，但它们却有不同的表达形式。TGF-β1主要在心血管系统中广泛表达，而其他亚型在特定的细胞和组织中有限表达。在正常心脏中，TGF-β1以复合物的形式存在，无法与其受体结合。心脏受损后，细胞外TGF-β1浓度主要是通过将其复合物转化为活性形式来调节[10]。心脏TGF-β1过表达能够诱导心室纤维化，增加胶原蛋白沉积和抑制间质胶原酶活性。TGF-β1能够诱导成纤维细胞活化并增加细胞外基质蛋白合成。TGF-β1对其他类型细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞)的作用可能以旁分泌的方式促进纤维化反应[11]。

TGF-β1可与细胞表面的组成型活性Ⅱ型受体(TβRⅡ)结合，形成异源二聚体复合物，该复合物可使组成型活性Ⅰ型受体(TβRⅠ)磷酸化激活，然后作用于R-Smad蛋白，Smad2和Smad3表达增加，同时磷酸化并与Smad4形成转录复合体，进入细胞核内，介导后续的细胞信号传导。TGF-β1还可以通过刺激非经典Smad通路促进纤维化，例如MAPK通路[12]。

1.2.3 氧化应激 氧化应激是指在机体受到有害刺激时，体内高活性分子如活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基产生过多，氧化作用和抗氧化作用失衡的一种状态。氧化应激通过直接作用以及细胞因子和生长因子信号转导参与心肌纤维化的发病[13]。ROS通过调节基质蛋白的表达和代谢，直接调控细胞外基质蛋白的数量和质量。持续的氧化应激会激活心脏成纤维细胞的MMP，减少纤维胶原的合成。除了直接作用外，ROS也是细胞因子和AngⅡ诱导成纤维细胞作用的关键介质。AngⅡ激活下游的ROS敏感激酶，这些激酶在介导心肌纤维化的重构中至关重要。以线粒体为靶点，过表达过氧化氢酶(catalase，CAT)的小鼠心脏在AngⅡ灌注后对心肌肥厚和纤维化有抵抗作用，证明线粒体氧化应激介导了AngⅡ诱导的纤维化性心肌病[14]。

1.2.4 炎症反应 心肌细胞的死亡迅速激活了固有的免疫途径，触发炎症细胞因子、趋化因子和黏附分子的表达，导致白细胞浸润并引发炎症反应[15]。心肌纤维化与肥大细胞浸润有关，心力衰竭和心室重构会引起肥大细胞数量增加。肥大细胞脱粒导致多种促纤维生成介质释放，包括组胺、糜蛋白酶、肥大细胞特异性蛋白酶以及细胞因子和生长因子(TGF-β和TNF-α)，进而导致成纤维细胞的活化、增殖和分化[16]。随着死细胞的清除、炎症细胞凋亡和抑制性介质的激活，炎症反应受到了控制。

2 BRD4

表观遗传学旨在研究在DNA序列不改变的基础上的细胞表型和基因表达的差异。表观遗传调控主要包括组蛋白修饰、非编码RNA、DNA甲基化和染色质重塑，其中组蛋白的翻译后修饰近几年研究的最广泛。在染色质组蛋白位点上可发生特异性的翻译后修饰，如甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等，这些修饰灵活地影响着染色质的结构与功能[17]。含溴结构域蛋白是唯一可以识别组蛋白赖氨酸乙酰化修饰的蛋白。根据其序列的相似程度，这些含有溴结构域的蛋白分为9个家族，这些家族中最大的并且研究最多的是BET家族。BET家族由BRD2、BRD3、BRD4和组织特异性BRDt蛋白组成[18]，在其N末端具有两个保守的含溴结构域(BD1和BD2)。BET蛋白识别乙酰化的组蛋白，并通过BD1和BD2与乙酰化的赖氨酸残基结合来控制转录活性，从而充当蛋白质乙酰化的读取器。同时，BET蛋白的N末端和C末端结构域可与转录因子和染色质组蛋白修饰剂结合，从而募集这些共同调节因子至启动子或增强子位点以调节基因转录[19]。这些蛋白质位于细胞核中，调节细胞活动，包括基因转录、DNA复制和细胞周期进展，并因此参与肿瘤发生、感染、自身免疫和炎症[20]，但它们之间的功能差异尚不明确。

3 BRD4参与心肌纤维化的调控

有学者[21]发现了一种有效且高度特异性的溴结构域抑制剂JQ1，该抑制剂可取代染色质上乙酰化赖氨酸的BET溴结构域来抑制下游基因表达。JQ1也一直被认为对多种恶性血液病细胞具有有效的抑制作用，包括多发性骨髓瘤[22]、急性髓细胞白血病[23]和伯基特淋巴瘤[24]，然而在非恶性细胞中研究较少。最近关于JQ1的一项专利值得关注，此专利发现通过使角膜基质细胞接触有效量的JQ1或其衍生物，可以减少角膜瘢痕形成，或反转、改善和治疗角膜瘢痕[25]。多项研究表明，BRD4参与调控组织纤维化，BET家族抑制剂能够有效地改善病理性纤维化反应，如JQ1能够减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化[26]和单侧输尿管梗阻引起的肾纤维化[27]。Song等[28]发现JQ1能够减轻主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)、TGF-β诱导的内皮-间质转化(endothelial mesenchymal transition，EndMT)和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成。EndMT是心肌纤维化的关键因素，是心肌成纤维细胞的重要来源之一。BRD4在压力超负荷小鼠心脏内皮细胞中的表达上调，JQ1可以有效抑制TAC诱导的成纤维细胞增殖并起到一定的心脏保护作用。体外实验[24]中，在脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)和小鼠主动脉内皮细胞(mouse aortic endothelial cell，MAEC)中，JQ1和沉默BRD4均有效地抑制了TGF-β诱导的迁移、EndMT和ECM合成，这与下调一组特异性针对EndMT的转录因子(Snail、Twist和Slug)、Smads途径和TβRⅠ有关。在没有TGF-β刺激的情况下，仅BRD4的异常表达也可以促进EndMT，加速迁移并增加ECM的合成。在体内试验中，JQ1可抑制TAC诱导的EndMT和成纤维细胞增殖，这与JQ1在细胞内作用一致[24]。JQ1还能够抑制心肌成纤维细胞激活标志物Postnd的表达[29]。这些发现，证实了BRD4参与调控心肌纤维化。

Stratton等[29]发现在TGF-β介导的心脏成纤维细胞活化过程中，BRD4的染色质动态靶向调控部分受MAPK的控制。BRD4可通过其末端羧基部位与细胞周期依赖蛋白激酶9(CDK9)结合并激活RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)，CDK9使PolⅡ尾部的丝氨酸磷酸化，导致转录延长，并激活下游靶基因(如SERTAD4)，进而引起成纤维细胞的活化和肌成纤维细胞ECM蛋白的大量积累，最终形成纤维化。SERTAD4是SERTAD蛋白家族的成员，也称为调控周期蛋白依赖蛋白激酶SEI[30]。SERTAD蛋白的特征是存在保守的SERTA(SEI、RBT1、TARA)域。该家族成员可通过与CDK/细胞周期蛋白复合物相互作用来调节细胞周期的进程，还可以作为转录辅助因子来促进或抑制转录因子E2F的转录。SERTAD4是一种具有内在转录活性的核蛋白，最近研究[29]发现SERTAD充当Smad1的转录共激活因子，以刺激Smad/BMP靶基因的表达。TGF-β可上调SERTAD4的表达，敲低SERTAD4会减弱TGF-β诱导的心脏成纤维细胞活化标记的表达。因此推测，SERTAD4蛋白在Smad/BMP 通路中起正反馈作用，并通过Smad蛋白促进TGF-β依赖性基因表达，从而导致病理性心肌纤维化。然而目前仅发现SERTAD4与纤维化有联系，其他基因是否参与其中仍未得知，需要进一步的探索。

在炎症相关研究方面，JQ1能够抑制MAPK/NF-κB通路，减轻脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导的小胶质细胞[31]和血管内皮细胞的炎症反应[32]。Jiang等[33]发现BRD4可抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)和NF-κB通路，有可能成为骨关节炎治疗的潜在靶点[33]。因此靶向BRD4是治疗炎性疾病的新方法。Bitzer等[34]的研究证实，小鼠胚胎成纤维细胞在受到LPS或促炎细胞因子TNF-α和IL-1刺激后，NF-κB/RelA通过激活Smad7基因转录诱导Smad7蛋白合成。Smad7在Smad家族中是一种特异性的内源性抑制因子，对TGF-β/SMAD信号转导起负反馈调节作用，从而延缓纤维化的进程[35]。JQ1可通过抑制NF-κB/RelA信号通路，消除细胞因子诱导的肝星状细胞的活化[36]。TGF-β能诱导细胞内源性Smad7的表达，但表达程度较弱，不能抵抗TGF-β活化R-Smads而产生的纤维化效应。BRD4参与调节p-TEFb(CDK9和细胞周期蛋白T的复合物)依赖性促炎靶基因的转录，是NF-κB转录共激活的必需。同时BRD4通过与细胞中的NF-κB亚基Rel A相互作用介导炎症反应。感染、炎症或损伤可以激活巨噬细胞，进而促进多种促炎介质的产生，例如ROS、一氧化氮(NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，以及多种促炎细胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α)。Belkina等[37]发现，LPS刺激巨噬细胞会引起BRD4表达升高，JQ1可使激活的巨噬细胞中关键炎症基因表达下调，因此JQ1是一种有效的巨噬细胞激活调节剂。然而，这些炎性基因在JQ1单独使用时不受影响。总体而言，这些结果表明BRD4可能是治疗炎症有效的靶标，并证明了在炎性疾病中进一步研究BET蛋白靶向基因的合理性。炎症反应在心肌纤维化的进程中起到重要的作用。由于巨噬细胞表型和功能的多样，使其有促纤维化和抗纤维化的双重作用，其具体作用主要有参与反应的细胞亚型和微环境。所以，巨噬细胞的分化和激活可能刺激成纤维细胞的活化。

在多发性骨髓瘤实验模型中，JQ1表现出较强的抗增殖作用，与细胞生长停滞和衰老相关，JQ1主要抑制致癌基因c-myc的表达[38]。c-myc是编码多种基因转录因子的主要致癌基因，并参与细胞周期、细胞增殖和凋亡相关基因的调控；其作用不仅局限在肿瘤细胞中，在小鼠肾纤维化模型中，c-myc可直接与肾成纤维细胞整合素αV的启动子结合，从而激活其转录，5个含有αV的整合素与不同的β亚基结合可以激活TGF-β[27]。抑制c-myc可减轻体内的肾纤维化，并在体外抑制肾成纤维细胞的增殖和活化；所以，靶向c-myc可能在肾纤维化的治疗中具有临床效用；在多囊肾病小鼠模型中，JQ1可通过抑制c-myc基因表达和囊性上皮细胞增殖来延迟囊肿增长[39]。因此JQ1是否能够通过抑制c-myc的表达进而影响心肌成纤维细胞的增殖、改善心肌纤维化，值得进一步研究。

JQ1在TGF-β1诱导的氧化应激和Nox4介导的纤维化中也起到抑制作用[40]。综合分析，以含溴结构域蛋白和纤维化驱动因子为抑制靶点可能对治疗心肌纤维化有临床益处。然而心肌纤维化涉及的机制复杂，BRD4与心肌纤维化之间是否存在更多的联系也需要进一步研究。

4 BRD4抑制剂在心血管疾病中的应用前景

目前正在进行临床试验的BET抑制剂至少有23种，如抑制剂CPI-0610针对淋巴瘤[41]，I-BET762针对睾丸核蛋白中线癌[18]，OTX015针对急性白血病和非小细胞癌[42]。临床前研究和临床评估试验结果显示，在某些情况下，使用BET抑制剂治疗癌症同时也导致小肠表皮增生、细胞多样性减少、干细胞衰竭、胃肠道局部毒性(腹泻、恶心、呕吐)、疲劳、高胆红素血症、血小板减少、贫血，以及肾脏损伤等不良反应，并且显示出有限地抗肿瘤活性以及与细胞毒性相关的次级效应[43]。这些局限性提示我们需要在以BET蛋白为靶点基础上寻求新的治疗方法。近几年的研究证实BRD4是纤维化反应的驱动因素，但是其作用不仅局限于心肌纤维化方面。越来越多的实验数据显示BRD4在心血管疾病中的重要作用，而这些正在进行的临床试验的结果将帮助我们了解BET抑制剂是否可以用于心血管疾病患者。

已有研究[40]表明，BRD4在大鼠心肌肥厚病理状态下高表达,并且JQ1可减轻心肌细胞肥大，并证实了BRD4是导致心脏肥大这一病理过程中基因激活的重要诱导因子。Ma等[44]发现用siRNA敲低BRD4的表达后，可上调ApoA1表达，阻碍动脉粥样硬化的发展和其他炎症发生。在小鼠的主动脉横向缩窄模型中，JQ1还能够降低心力衰竭的多个主要特征基因(Myh7、CTGF、Nppa、Nppb和Rcan1)的表达[25]。以上研究进一步证实以BRD4为靶点的抑制剂应用在心血管疾病中的潜力。

BRD4的N末端具有两个保守的溴结构域BD1和BD2，Kulikowski等[45]证实BD1和BD2在生物学功能和治疗作用中的差异。稳态基因表达主要需要BD1，而由炎症刺激诱导基因表达快速增加则需要BD1和BD2。BD1抑制剂在癌症模型中表现出了广谱BET抑制剂的作用，而BD2抑制剂主要在炎性和自身免疫性疾病模型中有效。治疗动脉粥样硬化和2型糖尿病的BRD4(BD2)选择性抑制剂Apabetalone(RVX-208)[46]已在2型糖尿病和高风险心血管疾病患者中进行评估；从肾功能不全患者血浆蛋白的生物信息学分析表明，该抑制剂可以调节涉及免疫、炎症、氧化应激、内皮功能障碍、血管钙化和凝血等生物过程。RVX-208已被美国食品药品监督管理局授予突破性疗法认定，与最佳治疗标准的他汀类药物结合，可用于2型糖尿病和早期急性冠状动脉综合征患者主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events，MACE)的二级预防。尽管目前已经存在多种治疗心血管疾病的药物，例如降血脂药(他汀类药物)、降低心率药(如β受体阻断剂)以及降血压药物(如ACEI类)，但仍存在因患者接受该治疗而出现MACE的较大残余风险。RVX-208与包含他汀类药物在内的最佳治疗标准相结合这一新型疗法，将有望成为糖尿病高危人群重要的差异化治疗方法。到目前为止，RVX-208是BET抑制剂应用在心脑血管领域的第一个品种。

5 结语

心肌纤维化是一个复杂的病理过程，长期的压力超负荷、氧化应激、炎症反应等是其主要诱因，并涉及神经内分泌系统、免疫系统等[47]，其发病机制尚未研究透彻。BRD4是促纤维化BET蛋白家族中关键的成员，随着RVX-208进入Ⅲ期临床试验，越来越多的研究人员开始关注选择性BRD4抑制剂在心血管疾病中的保护作用，但是BRD4与心肌纤维化涉及的下游信号传导还需要进一步探索；人们对BRD4抑制剂潜在毒性的担忧，将指导开发更具选择性的抑制剂而不是广谱BET抑制剂。