LncRNA基因调节的炎症信号通路在早期自然流产中的作用

张敏 徐清华 许鹏宇 李冬秀

早期流产是指在妊娠12周以前发生腹痛、阴道流血的现象，主要症状为阴道流血不多，下腹部疼痛不严重。早期流产时，绒毛与子宫底蜕膜的联系尚不牢固，常先有阴道流血，然后伴有阵发性下腹疼痛。出血由于绒毛和蜕膜分离，血窦开放引起，而腹痛由于宫腔积血刺激子宫收缩所致。早期流产给家庭和社会经济带来了严重的负担。早期自然流产属于早期流产中的一种，往往与遗传因素有关，最近有研究表明LncRNA基因与Treg/Th17等表达失衡有关[1-3]。而Treg/Th17的失衡又被证实与早期自然流产有关[4-7]，由此可推测LncRNA基因调节的炎症信号通路参与了早期自然流产的发展过程，但目前缺乏相关研究证实，为此我们设计了本研究。

对象与方法

1.对象：收集我院2013—2017年收治的早期自然流产患者198例作为病例组，同期收集至我院的正常早孕行人工流产妇女50例作为对照组。病例组纳入标准：(1)头臀部长度≥7 mm时无胎心搏动；(2)妊娠囊直径≥25 mm；(3)无卵黄囊的妊娠囊在11 d或更长时间后未见胚胎和胎心搏动；(4)超声显示无卵黄囊的妊娠囊未见胚胎及胎心搏动≥2周；(5)孕十二周内出现难免流产；(6)年龄18～46岁；(7)同意参与本研究并签署知情同意书。排除标准：(1)诊断不明确；(2)生殖系统结核等其他重大病变；(3)外伤等明确诱因导致的早期流产；(4)恶性肿瘤；(5)既往流产史。对照组为正常早孕行人工流产妇女，年龄为18～46岁之间，均无全身系统性疾病的健康女性。本研究已经征得我院伦理委员会批准。

2.检测方法：TRIzol法提取绒毛组织中RNA，260～280nm处测定光密度值，逆转录出cDNA，利用Primer premier5.0软件设计引物，设计相应内参，SYBR法进行pPCR，pPCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15秒，60℃退火延伸60秒，40循环。2-△△t法计算H19 LncRNA相应含量。RIPA法提取绒毛组织中总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，Western blot法测定ZEB1相对表达量。取静脉血5ml，密度梯度离心法分离组织中淋巴细胞，PBS溶液洗涤3次，加入相对应的单克隆抗体，室温反应30min后，利用Epics XL型流式细胞仪(美国Beckman coulter公司)检测Treg/Th17表达量。不同患者的指标检测分批检测，不同批次之间已经由我院检验科进行质控。观察指标包括(1)绒毛组织中H19 LncRNA和ZEB1相对表达量。(2)年龄、孕周、身体体重指数、停经天数、孕囊直径。

结果

1.两组一般资料比较：两组年龄、身体体重指数、孕囊直径、停经天数和孕周等差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.两组绒毛组织中H19 LncRNA相对表达量：病例组H19 LncRNA相对表达量低于对照组，见表2。

表2 两组绒毛组织中H19 LncRNA相对表达量

*P<0.05，与对照组相比

3.两组绒毛组织中ZEB1相对表达量：病例组ZEB1相对表达量低于对照组(0.24±0.15 vs.0.45±0.14,P<0.05)。见图1。

图1 两组绒毛组织中ZEB1相对表达量

4.两组外周血中Treg/Th17表达量：与对照组比较，病例组Treg水平显著降低；Th17显著增高。见表3。

表3 两组外周血中Treg/Th17表达量

*P<0.05，与对照组相比

5.早期自然流产患者绒毛组织中H19 LncRNA、ZEB1与Th17、Treg的相关性：Pearson线性相关性分析：显示H19 LncRNA、ZEB1与Treg显著正相关(r=0.256和0.241，P<0.05)，与Th17显著负相关(r=-0.243和-0.228，P<0.05)。

讨论

自然流产的发生率高达15%。发生在12周以前的流产定义为早期流产，妊娠12周至28周的流产则称为晚期流产。早期自然流产多数与遗传因素有关，部分患者可反复早期自然流产。本研究探讨了LncRNA基因调节的炎症信号通路在早期自然流产中的作用，结果显示与自愿选择流产的正常孕妇相比，早期自然流产的H19 LncRNA相对表达量、ZEB1相对表达量降低，且H19 LncRNA、ZEB1与Treg显著正相关，与Th17显著负相关。

目前研究已经证实，早期自然流产的患者存在Th17/Treg的平衡失调，表现为Th17增高，而Treg降低[8]。Th17/Treg的平衡失调可以诱导大量的Th1型细胞因子分泌，对胚胎的着床、植入和胎儿生存尤为不利。Th17是一种新发现的能够分泌白介素17的T 细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。β 转化生长因子、白介素-6、白介素-23 和白介素-21 在Th17 细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用，而γ 干扰素、白介素-4、细胞因子信号传送阻抑蛋白3和白介素-2则抑制它的分化。Treg是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，可分为天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。Treg降低时常常表现为炎症扩大。本研究中显示与自愿选择流产的正常孕妇相比，早期自然流产的Th17增高，而Treg降低，说明早期自然流产的患者体内存在慢性炎症，这种慢性炎症不利于胚胎的着床、植入，从而诱导流产[5,7,9-12]。由上可见，Th17/Treg的平衡失调参与了早期自然流产的发生和发展过程。

另有研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)异常表达可以扰乱Th17/Treg的平衡[1-3,13,14]，提示LncRNA可以间接通过影响Th17/Treg的平衡，从而参与了早期自然流产的发生过程。LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA 在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。曾有研究初步表明LncRNA的异常表达可能与早期自然流产有关[15]。我国学者胡炼等研究也表明了ZEB1在早期自然流产的患者中低表达，但与本研究不同的是，该研究中H19 LncRNA在早期自然流产患者中虽有降低趋势，但无统计学意义，这可能与研究样本量不足有关[16]。此外，上述研究未对LncRNA介导早期自然流产的机制进行探讨，本研究发现H19 LncRNA和ZEB1的低表达与Treg显著正相关，与Th17显著负相关，提示了LncRNA的异常可能是通过调控Th17/Treg的平衡失调，进而参与了早期自然流产的发生和发展过程。研究提示或许通过调节LncRNA基因的表达水平，可以减少早期自然流产率，但目前这方面尚未见相关报道。本研究的主要不足是对照组病例数相对较少，未对其进行干预治疗，尚需深入的研究证实调节LncRNA基因表达水平是否有益于改善孕妇预后，减少早期流产。

综上所述，绒毛组织中H19 LncRNA、ZEB1的低表达与早期自然流产和Th17/Treg免疫失衡有关。