植物缩合单宁抗氧化作用机制的研究进展

彭 凯 王国霞 孙育平 陈 冰 莫文艳 黄燕华

（广东省农业科学院动物科学研究所广东省畜禽育种与营养研究重点实验室农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东广州510640）

随着养殖规模化和集约化的迅猛发展，动物在养 殖过程中所面临的人为活动、环境变化、饲料和水体中有毒有害物质等各种应激因子日益增加，从而造成氧化应激。氧化应激是多种疾病发生的重要病理机制之一。氧化应激状态下，机体组织和细胞内氧自由基生成增加，导致活性氧家族累积而引起细胞氧化损伤，使机体抗氧化和免疫力下降并引发大规模病害，影响生产性能、产品品质和食品安全，同时给养殖业带来严重的经济损失。动物的健康程度与机体抗氧化防御体系的能力密切相关。应用天然抗氧化活性物质提高动物的抗应激能力、降低病害的发生，是高效健康养殖和维持养殖业可持续发展的重要途径，也是动物营养调控的研究热点之一。但由于动物内源性抗氧化应激途径及自身防御机制仍不完全清楚，导致外源添加剂对机体抗氧化作用的调控机理不明，从而严重制约了抗氧化活性物质的应用。

缩合单宁（Condensed tannins）是由黄烷-3-醇单体组成的多酚化合物，是一种天然、绿色、安全的生物抗氧化剂，其抗氧化功能在食品和医疗行业已被人们所认知[1]。缩合单宁属于植物次级代谢产物，在自然界中分布广泛，常见于乔木、灌木、草本植物（百脉根）、豆科牧草（红豆草、紫色达利菊）、谷物（高粱、黍、大麦、木薯）和水果（葡萄、黑莓、柿子、香蕉）之中，主要存在于细胞壁或植物的茎、皮、叶、花、种子之内。与化学合成的抗氧化剂相比，缩合单宁具有安全性高、残留及毒副作用小、抗氧化活性高等优点，在抵御或减轻氧化应激对机体的危害、减少动物疾病、提高生产性能等方面表现出巨大的研究价值和开发潜力。在抗氧化过程中，缩合单宁通过与苯酚耦合发生低聚反应，导致自身反应结合位点数量增加，因此比低分子量的多酚化合物表现出更强的抗氧化能力[2]。近年来研究发现，缩合单宁具有提高机体抗氧化能力、清除自由基的功能，这对于预防疾病、修复受伤机体、增强动物健康等具有重要意义。本文概括了近年来缩合单宁抗氧化生物活性及其作用机理的研究进展，介绍了缩合单宁在促进动物抗氧化应激和增强机体健康上的应用。

1 缩合单宁对抗氧化酶的调控作用

已有研究表明，提高动物机体抗氧化能力的根本措施是通过提高酶促体系的功能[3]。天然多酚类化合物作为抗氧化剂的研究已被广泛报道[4-5]。研究表明，单宁比低分子量多酚或非酚类抗氧化剂具有更强的抗氧化能力[2]。关于体外试验对于单宁的抗氧化活性已有大量报道[6-9]，而体内试验也证实了单宁能够提高动物血液[10-11]、肌肉[12]和肝脏[13]的抗氧化能力。Peng等[14]研究表明，缩合单宁通过提高血清总抗氧化能力和过氧化氢酶（CAT）活性增强绵羊的抗氧化能力。Frankič等[15]指出，栗木单宁可通过降低尿中丙二醛（MDA）浓度和减少血清淋巴细胞DNA损伤来缓解仔猪的氧化应激。Wang 等[16]研究发现，葡萄籽缩合单宁通过降低肉鸡血浆一氧化氮和MDA 浓度，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，进而减少机体氧化损伤。刘华伟[17]在兔日粮中添加栗树缩合单宁可显著清除对1,1-二苯基苯肼（DPPH）自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基，降低肝脏中MDA 含量，提高SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，增加肝脏中GSH-Px、SOD基因的表达量。

2 缩合单宁对Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化信号通路的调控作用

由氧化应激所产生的活性氧自由基直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发病的根本原因。Keap1-Nrf2/ARE 信号通路，即Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2 相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路，是迄今为止发现的细胞抗氧化机制中最重要的通路。Keap1-Nrf2/ARE 信号通路是调节机体内多种抗氧化酶表达的关键通路。Nrf2以Ke⁃ap1-Nrf2/ARE 信号通路介导并激活下游多种抗氧化相关基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录，从而减轻活性氧自由基（ROS）和亲电子物质引起的细胞损伤，在细胞防御保护和维持机体氧化与抗氧化生理平衡中发挥着重要作用，是近年来抗氧化研究领域的热点。目前，大量研究报道了Keap1-Nrf2/ARE 信号通路在抵御氧化应激、炎症、肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病等多种病理生理进程中发挥的重要角色。正常生理状态下，Nrf2以非活性状态存在于胞浆中，与Ke⁃ap1 通过与同源结构域Neh2 区偶联并与胞浆肌动蛋白结合被锚定在胞浆中；当细胞或机体处于氧化应激或亲电子物质的刺激下，Keap1结构发生变化从而与Nrf2解偶联，解离的Nrf2随后进入细胞核与ARE启动子结合，并调控下游靶基因的表达[18]。Nrf2被认为是调节细胞对抗异源性物质和氧化损伤的关键转录因子[19]。关于Nrf2的活化机制，近年来研究发现激酶通路，包括丝裂酶原激活蛋白酶（MAPKs）、磷脂酰肌醇酶（PI3K）、蛋白激酶（PCK）等均参与Nrf2 的激活，原理是蛋白激酶能通过直接磷酸化Nrf2 的方式促使其与Keap1 解离，激活Nrf2[20]。Keap1-Nrf2/ARE 信号通路的调控是十分精细和复杂的，目前已发现该信号通路调节的可编码内源性保护基因超过200个，其激活的基因种类取决于激活剂类型和激活方式，且存在其他信号通路的参与。多数文献报道，Keap1-Nrf2/ARE信号通路的激活可启动下游一系列靶基因，如CAT、SOD、谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）、醌氧化还原酶（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）以及血红素加氧酶（HO-1）的表达[21-22]，进而抵抗各种刺激对机体产生的氧化损伤。当前对Keap1-Nrf2/ARE信号通路的研究集中于抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录诱导，这也是信号通路调控的关键一步，抗氧化蛋白的表达可以清除过多的由于氧化还原失衡而增加的自由基，有助于维持细胞内氧化平衡，使细胞免受损伤。

目前，少有文献报道缩合单宁对Keap1-Nrf2/ARE 信号通路的调控作用。Erlank 等[23]研究发现，叔丁基对苯二酚、白藜芦醇和姜黄素等多酚类化合物激活了细胞Nrf2/ARE 信号通路并增加了下游解毒酶的基因表达，Nrf2 和NQO1 的活性显著提高。Han 等[24]指出，茶多酚提高了Nrf2 和HO-1 的基因表达量，增强了大鼠的抗氧化能力。Tamaki等[25]研究表明，白藜芦醇能激活Nrf2/ARE 信号通路，改善8-羟基脱氧鸟苷和抗炎因子的基因表达水平以及NO 的代谢，从而减缓大鼠牙周炎。陈雁[26]发现，葡萄籽缩合单宁可激活Nrf2/ARE 信号通路，促进肾脏中Nrf2 及Ⅱ相解毒酶的表达，降低肾脏氧化损伤及细胞凋亡率。赵娇[27]研究表明，葡萄籽缩合单宁通过提高Keap1 的mRNA表达量以减轻活性氧自由基对仔猪肝脏的氧化损伤；通过减少内质网应激相关分子GRP78 的mRNA 表达量和肝脏caspase-12 含量以减轻内质网氧化损伤。莲子皮缩合单宁可有效激活Nrf2/ARE 信号通路，促进Nrf2 解离，从而提高抗氧化保护基因HO-1的转录水平[28]。饲料中添加400 mg/kg 葡萄籽缩合单宁不仅不影响花鲈幼鱼的生长性能，还能提高血清和肝脏抗氧化酶活性，并通过上调Nrf2基因表达降低10 h低氧胁迫累计死亡率[29]。

3 缩合单宁与肠道抗氧化细菌的相互作用

肠道是动物主要的消化代谢器官，也是缩合单宁作用的第一个靶点。然而，缩合单宁如何被肠道利用，以及提高肠道抗氧化状态的作用机理尚不明确。缩合单宁是由黄烷-3-醇单体组成的聚合物，分子量在1 000～20 000 Da 之间[30]。黄烷-3-醇单体容易被肠道直接吸收而发挥作用，但低聚合度或高聚合度的缩合单宁并不能直接被肠道利用，而是被肠道细菌降解或转化[31]。因此，人们推测缩合单宁的抗氧化作用可能存在其他重要的调控途径，比如可能是通过与肠道微生物的相互作用实现的。通过在饲料中添加益生菌，如乳酸菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、双歧杆菌（Bifidobaterium）、拟杆菌（Bacteroides）、肠球菌（Enterococcus）、芽孢杆菌（Bacillus）等，可增加动物肠道有益菌数量，修复肠黏膜损伤，从而增强宿主抵抗环境应激和肠道疾病的能力[32]。

细菌的抗氧化性是当前研究热点之一[33]。Lin等[34]报道，乳酸菌Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 和双歧杆菌Bifidobateriumlongum ATCC 15708均能够显著抑制血脂的脂质过氧化反应，清除2, 2-二苯基-1-苦基苯肼自由基（DPPH），发挥抗氧化效果。相似地，乳酸菌Lactobacillus fermentum被定义为抗氧化细菌，因为其具有清除活性氧、抵抗超氧阴离子自由基和过氧化氢的作用[35]。乳酸菌Lactobacillus plantarum KCTC 3099 和C88 可通过与金属离子Cu2+和Fe2+发生螯合，或通过增强抗氧化酶活性等方式清除活性氧自由基，增强抗氧化防御体系[36-37]。此外，一些乳酸菌被发现能够产生非酶类抗氧化活性物质，如谷胱甘肽、硫氧化还原蛋白，间接清除自由基[35]。

肠道菌群是多酚发挥生物活性的关键因素[38]。体内和体外研究均已证实，黄烷-3-醇单体和单宁可促进乳酸菌（Lactobacillus）和拟杆菌（Bacteroides）增殖，抑制梭菌（Clostridium）和葡萄球菌（Staphylococ⁃cus）生长，从而改善肠道健康[39]。研究发现，紫色达利菊缩合单宁可显著抑制大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922 和35218 的生长，促进乳球菌（Lactococ⁃cus）和明串珠菌（Leuconostoc）的增殖[40-41]。最新研究表明，缩合单宁可降低花鲈肠道梭菌（Fusobacteria）丰度，增加变形菌（Proteobacteria）丰度，提高花鲈血清和肝脏的抗氧化力[42]。在缩合单宁的干预下，肠道微生物结构组成可能发生变化，优势菌可直接发挥抗氧化作用，或者通过其代谢产物间接调控机体抗氧化状态。相反，缩合单宁也能够被肠道细菌降解或转化，其代谢产物对于增强机体抗氧化和维持肠道健康的作用不容忽视[43]。黄烷-3-醇，如儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素，可以被拟球梭菌（Clostridium coc⁃coides）和双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）降解，生成丙酸、戊酸和戊内酯等物质[44]。研究表明，日粮缩合单宁通过小鼠肠道菌群的降解产物还包括苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸、苯乳酸、间苯三酚和异丙醇及其衍生物，而在人肠道中的主要代谢产物为乙酸、苯丙酸、丙酸和戊酸[45]。尽管缩合单宁的微生物降解产物及其对肠道健康的保护作用已被人们所关注，现有研究仍然局限于少数单一菌属，且作用机理不明确，缩合单宁如何在鱼类肠道中代谢并发挥作用还不清楚。因此，当前研究的努力方向在于明确缩合单宁与肠道微生物的互作规律，以及探讨缩合单宁抗氧化作用的微生态机理。

4 结语

植物缩合单宁作为一种理想的抗生素替代品能够有效增强动物抗氧化能力，调节动物肠道健康，但其作用机制尚不清楚。以往研究多停留在抗氧化酶活性及其基因表达水平。近年来发现，Keap1-Nrf2/ARE 信号通路在抵御动物机体抗氧化应激过程中发挥的重要角色，缩合单宁可激活Keap1-Nrf2/ARE 信号通路，上调抗氧化酶基因表达，增强机体抗氧化状态。肠道菌群作为机体固有免疫的重要组成部分，其在抵御肠道氧化应激中发挥直接抗氧化性或关键调节作用。缩合单宁为聚合物，基本不被肠道吸收，而肠道菌群在缩合单宁发挥抗氧化作用中起关键作用。那么一系列科学问题值得我们深入探讨：①缩合单宁对动物肠道抗氧化性细菌的调控作用及其作用机理；②缩合单宁对动物肠黏膜损伤修复和结构完整性的影响；③缩合单宁的微生物降解产物与肠道抗氧化通路有何内在联系？未来研究应当更多关注上述一系列科学问题的解答，这将有助于我们更加明确缩合单宁调节肠道健康和提高机体抗氧化作用的分子机制，亦为营养调控动物抗氧化作用提供理论依据和新思路。