猪传染性胃肠炎病毒PCR检测方法研究进展

2020-12-30申识川刘文正

饲料博览 2020年3期

申识川，刘文正，李利

（1.濮阳市检验检疫服务中心，河南濮阳 457000；2.台前县农业农村局，河南台前 457600；3.营口市食品药品检验检测中心，辽宁营口 115004）

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的以脱水、严重腹泻、呕吐、肠绒毛萎缩、初生仔猪高死亡率为主要特征的一种接触性传染病，是造成哺乳期仔猪死亡的主要疫病之一。我国20世纪50年代开始有该病的报道，给我国养猪业造成了重大经济损失。如能在发病早期快速确诊该病，对于本病的防治具有非常重要的作用。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒病在临床症状、病理变化、流行病学等方面高度相似，仅靠临床症状很难确诊。因此，建立准确的猪传染性胃肠炎病毒的检测方法意义重大。本文综述了国内近几年PCR检测方法研究进展。

1 猪传染性胃肠炎病毒概述

TGEV属于冠状病毒科成员，该病毒形态在电镜下观察类似于王冠，基因组是连续单股正链RNA，全长28.6 kb，编码7 个开放阅读框，编码4 种结构蛋白和3 种非结构蛋白。目前研究表明，猪传染性胃肠炎病毒只有一种血清型。

2 猪传染性胃肠炎病毒PCR检测方法研究进展

TGEV 传统的病毒分离、荧光抗体试验等检测方法样品处理繁琐、耗时长，灵敏度低，不适合推广应用，随着PCR 技术的成熟，相关仪器和试剂价格的降低，PCR检测方法在动物传染病检测中已成为一种常规的检测方法。

2.1 RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

相对于病毒分离鉴定和中和试验，PCR 检测具有快速、准确、对人员和设备要求不高的优势，在基层得以广泛应用。王黎等根据TGEV的N基因序列建立了检测TGEV的RT-PCR 方法，并对猪传染性胃肠炎高发季节的四川省成都市、德阳市、绵阳市、遂宁市、南充市各地猪场送检的疑似病料进行了检测，检测结果表明在四川省的这些地区TGEV 的感染率非常高，此项研究为该病的防控提供了流行病学资料。满坤等根据TGEV的S基因建立的RT-PCR方法从河北某猪场疑似TGEV 的病猪小肠内容物中分离出了一株TGEV的强毒株，为进一步研究TGEV的变异情况提供了依据。

2.2 多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

多重PCR技术是在一个PCR反应体系中加入多对以上引物和多个模板，同时进行扩增的

PCR技术，可用一种病料通过一次PCR 反应，检测多种病原体，实现对多种疾病的诊断，被广泛应用于动物疫病检测。张坤、何启盖根据Gen Bank 收录的PEDV M 基因序列、TGEV N 基因序列和猪轮状病毒（GAR）VP 7 基因序列设计3 对引物，建立了能够同时检测PEDV、TGEV 和GAR 的多重PCR 方法，应用该方法检测了华中地区75 份腹泻猪粪样,结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR 的敏感性高、特异性强, 是一种有效检测PEDV、TGEV 和GAR的方法。

2.3 荧光定量PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

荧光定量PCR 技术是近年发展起来的基因检测技术，相对于传统PCR 具有扩增效率高、灵敏度更高、特异性好、能精确定量等优点，而且可以有效避免检测过程中的污染和假阳性问题。董玲娟等根据TGEV-TH98株的N基因序列建立的TGEV荧光定量RT-PCR检测方法，对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测，结果表明，该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR 方法高2个数量级，可应用于临床检测TGEV。龚双燕等建立的检测猪初乳的荧光定量PCR方法检测结果显示，荧光定量PCR检测方法的敏感性高于普通PCR 方法，可以用于猪初乳检测TGEV。

2.4 多重荧光定量PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

李军等根据Gen Bank 中登录的TGEV 的S 基因、PEDV的S 基因、猪轮状病毒（PRoV）A 型的NSP 基因序列，建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法，用建立的方法对来自广西壮族自治区、广东省、江苏省等地的9 个大型猪场的粪便、小肠和乳汁样品猪腹泻38份临床样品进行了检测，结果表明该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRoV，而与其他病原无交叉反应。