鸡细菌性病原多重PCR检测方法的建立及应用

余春林 杨礼 陈家磊 胡陈明 彭涵 邱莫寒 虎彪 杨朝武

1.四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室 610066

2.四川大恒家禽育种有限公司 610066

3.四川省正鑫农业科技有限公司 610400

鸡沙门氏菌、大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌是危害鸡群健康的常见细菌性病原，在我国各个代次鸡群中普遍存在，严重危害产业健康发展。多重PCR法已广泛用于病原菌的同时检测和鉴定，具有高效性、系统性、经济性和简便性。

林下养殖是充分利用林地资源，兼顾生态与经济效益的生产方式，在动物福利、生产性能、蛋肉风味、营养价值、植被保护等方面具有一定的优势。放牧及植物、土壤的摄取使鸡更频繁地暴露于环境污染物和病原体中，因此具有更高的食品安全和疾病感染风险[3]。本研究建立了一种能快速检测禽沙门氏菌、大肠杆菌和多杀氏巴氏杆菌的多重PCR方法，并应用于林下养殖环境中细菌性病原感染情况调查。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集 采用五点法采集无污染荒坡0-5cm土层5-10g，研磨过筛、高温灭菌后，-80℃保存备用。临床样本采用同样的方法采集，不经灭菌直接保存。

1.2 菌株 标准品沙门氏菌CVCC504、肠出血性大肠杆菌CVCC245、A型巴氏杆菌、肠毒性大肠杆菌CVCC196、鸭疫里默氏菌均为动物遗传育种四川省重点实验室保存。

1.3 引物设计 根据Genebank中登录的沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌（rfb E基因）和A型多杀巴氏杆菌序列设计引物（表1）。

表1 引物信息

1.4 细菌DNA提取 将3种标准品菌液等量混合，分为两份，其中一份经72℃水浴15min制成死菌悬液。参考何伟等[4]研究，将3种标准品菌液、活菌悬液和死菌悬液分别按105cfu/g加入5份灭菌土壤中混匀。采用土壤DNA分离试剂盒提取DNA，经质量浓度测定后稀释至50ng/ml。鸭疫里默氏菌和肠毒性大肠杆菌标准品采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取细菌DNA。

1.5 PCR扩增 单重PCR采用25ul反应体系，包括DNA模板1ul，上下游引物各1uL，2×PCRmix 18ul，ddH2O 4uL。采用50ul体系对多重PCR的引物浓度、退火温度、反应程序等进行优化。

扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6 方法验证 以1.4中提取的沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌和A型巴氏杆菌DNA混合液为模板，同时以鸭疫里默氏菌DNA、肠毒性大肠杆菌CVCC196 DNA、ddH2O为模板，经多重PCR扩增后采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行特异性检测检测，并重复3次以检测结果的可靠性。灵敏度检测包括10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等5个梯度。以活菌悬液和死菌悬液DNA为模板进行死菌和活菌鉴别。

1.7 多重PCR对临床样品的检测 样本来源于38个放养场，样本采集方法见1.1.1，并通过问询记录各场存栏品种、日龄、消毒方法等信息。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌DNA提取 经检测OD260/OD280比值均在1.8-2.0之间，可以用于后续PCR检测。

2.2 PCR方法的建立 3种标准品分别与土壤混合后提取的DNA，经单重PCR扩增，均能得到288bp、495bp和1044bp的特异性条带。经优化，多重PCR反应采用50ul反应体系，包括：DNA模板2ul，10umol/L上下游引物各2uL，2×PCRmix 36ul。最佳反应程序为：94℃预变性5min；加入引物P1，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5个循环；加入引物P2，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5个循环；加入引物P3，40个循环；72℃延伸10min。

2.3 方法验证 特异性检测结果发现仅活菌悬液能出现288bp、495bp和1044bp条带，其他工作液不能扩增出特异性条带；3次重复结果一致。DNA测序结果与Gen Bank中序列完全一致。说明该方法能特异性检测出沙门氏菌、A型巴氏杆菌和肠出血性大肠杆菌，能区分样品中的死菌与活菌。灵敏度分析显示5个稀释度的标准品混合液均能检出特异性条带。

2.4 对临床样品的检测 基于上述建立的方法，对采集的38份土壤样本的细菌性病原感染情况进行调查，结果显示所有样本均未检出A型巴氏杆菌；肠毒性大肠杆菌和沙门氏菌阳性率分别为68.42%和89.47%；混合感染率为36.84%。不同品种、不同日龄鸡群均有检测到不同细菌性病原感染。

3 讨论

多重PCR是针对待测病原设计特异性引物，在同一体系内反应并同时检测出多种病原，能极大减少试剂、人工、时间成本，在疾病的及时确诊方面具有优势。本研究中扩增特异性分析显示该方法能有效扩增出沙门氏菌、A型巴氏杆菌和肠出血性大肠杆菌，而作为对照的鸭疫里默氏菌、肠毒性大肠杆菌不能检出；试验中设置的5个稀释梯度的标准品混合液均能检出特异性条带，具有较高的灵敏性，能满足临床检测的需要；死菌悬液不能检出特异性条带，能有效区分土壤样本中的活菌和死菌；3次重复性试验结果一致性为100%，具有较好的重复性。

鸡沙门氏菌、大肠杆菌是长期存在于鸡群的肠道病原菌，多杀性巴氏杆菌主要引起呼吸道症状。放养鸡生产水平低下，环境可控性差，疾病防控压力巨大。据报道四川7个地区养鸡场鸡沙门氏菌感染的场阳性率达50%[5]。本研究中所有场样本均检出1-2种病原感染，其中沙门氏菌和大肠杆菌感染以及混感情况严重；所有样本均未检出多杀性巴氏杆菌，可能与其流行病学特征有关。不同品种、不同日龄鸡群均存在感染，提示各放养场均存在不同程度的生物安全漏洞，应从引种、饲养管理等多方面入手。