12类68种兽药残留同步检测方法的建立

鹿翠珍 王建娜 温春晓 王立国 西迎/正大集团（秦皇岛正大有限公司）066200

错综复杂的全球食品供应链既丰富了中国消费者的餐桌文化，也为食品安全的保障工作带来了新的挑战。如今，食品安全不再是传统的单个国家、企业或者行业组织就能解决的问题，而是需要全食品产业链乃至更广泛的社会力量的通力合作与共同治理。随着畜牧业规模化、商业化的发展，兽药及饲料添加剂在畜牧业生产中得到了广泛运用及食品数量和品种的急剧增多，兽药管控项目增加，限量加严，检测面临着人员、设备和空间的投入，越来越高昂的检测费逐渐成为企业监管瓶颈，因此急需要高效的精确的检测技术做保障。我们的科研方法就是本着这样的服务理念，采用兽残同步检测法，实现多种兽药残留快速、准确检测。

1 实验部分

1.1 试剂和材料

标准品：（纯度96%，标准物质均为德国Dr公司生产）、金刚烷胺D15（内标）、氘带磺胺甲恶唑内标、氘带诺氟沙星内标、内标罗红霉素：(纯度99%，德国)、甲醇（高效液相色谱级Dikma）、甲酸（高效液相色谱级Kermel）、乙腈（高效液相色谱级）、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、实验用水（超纯水）、柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。Mellvaine缓冲液：将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，用氢氧化钠溶液调节pH=4.0±0.05。Na2EDTA-Mellvaine缓冲液: 0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mL Mellvaine缓冲液，使其溶解、摇匀。甲醇水溶液（5%）：称量25mL甲醇与475mL水混合。定溶液：475mL水与25MmL乙腈与1.5mL甲酸混合。Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60mg，美国Waters公司，使用前依次用5mL 甲醇，10mL 水活）。混合标准工作液：使用标准储备液用甲醇稀释至适宜浓度。

混合内标工作液：使用内标标准储备液用甲醇稀释至适宜浓度。

1.2 仪器

API4500串联质谱仪、高速冷冻离心机、涡旋混合器、超声波、氮吹仪 精密分析天平（感量0.00001g）；天平（感量0.01g）、振荡器、绞肉机、空气真空泵、尼龙微孔过滤膜：∮ 0.22µm、酸度计。

1.3 分析步骤

1.3.1 试样的提取和净化 准确称取2.00g(精确至0.01g)试样至 50mL 离心管中，加入20mL 0.1mol/L Na2EDTAMellvaine缓冲液溶液，振荡15min，8000r/min，离心10min。移取上清液于上述已活化的HLB固相萃取柱中，控制流速为1mL/min，先用5mL水淋洗、再用3mL 5% 甲醇溶液淋洗，流干后真空泵抽干，然后用5mL 甲醇分两次洗脱。洗脱液在60℃水浴中氮气吹至近干，加1.0mL定溶液，涡旋30s溶解，用0.2μm滤膜过滤后供液相色谱- 质谱/ 质谱测定。

1.3.2 混合基质校准曲线的制备 称取5个阴性2.00g（精确至0.01g）试样至 50mL离心管中，加入适量的混合标准工作液及混合内标工作液，按照1.3.1步骤进行同步提取和净化。

1.4 色谱条件

色谱柱：Kinete®2.6µm 50×3.0mm。流动相：0.1%甲酸水（A）、乙腈（B）具体见表1。流速：400ul/min。

表1 流动相比例

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI源）、辅助加热器温度：500℃、正离子方式扫描/负离子扫描、检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5.5kV。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择和优化

肉类样品的主要成分是水(高达70%)、蛋白质(15%～25%)、脂肪(5%～25%)和磷脂(1%～3%)。蛋白含量高，选用沉淀蛋白效果佳的物质作为提取剂，本研究分别用乙腈、三氯乙酸、乙酸铅、Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液，结果发现，在提取过程中，Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液净化处理效果最佳，试验过程中用0.1mol/L Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液变性形成沉淀，通过离心后除去。

2.2 提取方式的选择

分别采用涡旋、超声波提取、均质提取和振荡4种提取方式。结果表明，振荡提取效果最好，而且回收率比较稳定，因此本方法采用振荡的提取方式。

2.3 净化方法

动物源性食品中基质复杂，净化样品，降低杂质对测定的影响十分重要。净化过程我们选用兽残常用前处理柱MCX小柱、HLB小柱、C18。MCX小柱68项满足回收率要求项目有48项，成功率为70.6%，其中四环素族和大抗球虫类 无法保留，不采取；C18小柱68项满足回收率要求项目有45项，成功率为66.2%，其中磺胺类、喹诺酮类及酰胺醇类无法保留，不采取；HLB小柱68项全部满足回收率要求，因此本方法采用HLB净化柱。

2.4 流动相梯度选择

本试验包括正离子和负离子，流动相的pH值影响正负离子的离子化，采用0.005%甲酸-乙腈水溶液，0.01%甲酸-乙腈水溶液，0.1%甲酸-乙腈水溶液，0.2%甲酸-乙腈水溶液，0.5%甲酸-乙腈水溶液 逐个梯度摸索流动相条件，结果表明，0.1%甲酸-乙腈流动相体系在一定梯度下可以很好地将68种兽残分离开来，其灵敏度和分辨率都满足实验要求。

2.5 样品基质效应的消除

在应用超高效液相色谱-串联质谱法测定复杂样品时，基质对于药物的响应有很大不同，对不同的药物具有增强或抑制效应，从而影响定量的准确性。本方法为了消除基质效应对检测结果的影响，日常定量用标准曲线采用5点及以上阴性样本添加方式。

2.6 方法的检出限、回收率、重复性及线性范围

以阴性鸡肉为代表，按照上述处理方法对样品中68种兽药进行10、20、50μg/kg等3个浓度水平的添加回收试验，其平均回收率在82.2%～102.6% 之间，RSD在2.9%～20.9%之间。本试验采用在空白组织中添加目标组分的方法，依据特征离子色谱峰的3倍信噪比（S/N）计算最低检出限，结果见表2。

表2

项目 母离子子离子 扫描模式线性范围相关系数最低检测限ppb替米考星 869.5 174.0 + 0.5-100 0.998 1 869.5 132.4 +吉他霉素 772.0 109.0 + 0.5-100 0.995 1 772.0 173.7 +泰乐菌素 916.6 174.0 + 0.5-100 0.998 1 916.6 145.4 +克林霉素 425.3 125.8 + 0.5-100 0.998 1 425.3 377.2 +土霉素 461.0 425.9 + 5-100 0.999 10 461.0 443.1 +四环素 445.1 410.0 + 5-100 0.996 10 445.1 154.0 +金霉素 479.1 444.0 + 5-100 0.997 10 479.1 462.3 +强力霉素 445.1 428.1 + 5-100 0.996 10 445.1 410.1 +克球酚 192.1 101.0 + 5-100 0.998 10 192.1 87.2 +卡巴氧 263.2 230.9 + 0.5-100 0.997 1 263.2 90.1 +喹乙醇 264.3 143.1 + 0.5-100 0.998 1 264.3 212.1 +阿奇霉素 749.6 591.7 + 0.5-100 0.998 1 749.6 157.9 +甲硝唑 172.1 127.9 + 0.5-100 0.998 1 172.1 82.1 +羟基甲硝唑 188.1 126.0 + 0.5-100 0.998 1 188.1 123.0 +二甲硝唑 141.9 96.1 + 0.5-100 0.996 1 141.9 81.1 +羟甲基甲硝唑158.1 140.1 + 0.5-100 0.999 1 158.1 112.2 +阿莫西林 366.0 114.2 + 5-100 0.996 10 366.0 208.3 +氨苄西林 350.0 160.2 + 5-100 0.996 10 350.0 191.9 +泰妙菌素 494.1 192.1 + 0.5-100 0.997 1 494.1 119.0 +金刚乙胺 180.2 163.1 + 0.5-100 0.997 1 180.2 121.2 +氯霉素 320.9 152.0 - 0.1-100 0.995 0.1 320.9 257.0 -地塞米松 436.9 361.3 - 0.5-100 0.999 1 436.9 307.4 -甲砜霉素 354.1 184.9 - 0.5-100 0.997 1 354.1 289.8 -氟苯尼考 356.1 335.7 - 0.5-100 0.996 1 356.1 185.2 -磺胺甲噻二唑271.0 156.0 + 5-100 0.996 10 271.0 108.0 +磺胺 唑 268.0 156.0 + 0.5-100 0.997 10 268.0 113.0 +

项目 母离子子离子 扫描模式线性范围相关系数最低检测限ppb磺胺醋酰 215.0 156.0 + 5-100 0.997 10 215.0 108.1 +苯甲酰磺胺 277.0 156.0 + 5-100 0.996 10 277.0 108.0 +磺胺苯吡唑 315.0 156.0 + 5-100 0.997 10 315.0 160.0 +磺胺邻二甲氧嘧啶311.0 156.0 + 5-100 0.998 10 311.0 108.0 +磺胺异 唑 268.1 156.0 + 5-100 0.999 10 268.1 113.0 +甲氧苄啶 291.1 230.1 + 5-100 0.996 10 291.1 261.0 +泰万菌素 1042.6109.0 + 0.5-100 0.997 1 1042.6814.5 +氟苯尼考胺 248.0 230.0 + 0.5-100 0.997 1 248.0 130.0 +螺旋霉素 843.3 174.2 + 0.5-100 0.999 1 843.3 142.2 +磺胺氯吡嗪 285.2 156.2 + 5-100 0.997 10 285.2 108.3 +喹乙醇代谢物189.2 145.1 + 0.5-100 0.998 1 189.2 143.1 +苯硫胍 447.1 383.0 + 5-100 0.996 10 447.1 415.0 +芬苯哒唑 300.0 267.9 + 5-100 0.995 10 300.0 158.7 +氨丙啉 243.0 150.0 + 5-100 0.997 10 243.0 94.0 +阿苯达唑 266.0 233.9 + 5-100 0.998 10 266.0 190.9 +奥芬达唑 316.0 158.9 + 5-100 0.995 10 316.0 190.9 +阿维拉菌素 249.0 190.3 - 5-100 0.999 10 249.0 205.0 -

3 结论

本方法建立了动物源性食品中68种药物残留的超高效液相色谱-串联质谱法测定方法。该方法简单、快捷、准确，重现性好，回收率和检测限GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F的规定，，适合动物源性食品中12类68种药物残留的日常分析。