下一代测序技术在遗传病诊断中的应用进展

鲁丹阳 林仙华 黄荷凤

遗传病是指遗传物质发生改变导致的疾病，包括胚系遗传病和体细胞遗传病两大类。遗传学分子诊断是指应用分子遗传学技术对染色体、基因组、DNA序列进行检测，判断患者是否存在遗传物质突变。其中，DNA测序技术是最重要的分子诊断手段。自1977年Sanger发明DNA测序技术[1]以来，DNA测序水平得到了显著提高，尤其是在最近十几年间快速发展的下一代测序(next-generation sequencing，NGS)技术已被广泛应用于临床和科学研究中。NGS是基于第1代测序技术的新型测序技术，自2005年基于焦磷酸测序法的高通量测序系统应用于临床以来[2]，NGS技术摒弃了Sanger测序低通量、测序时间较长和成本高的缺点，以高通量、低成本的优势运用于遗传病的诊断中，可一次性检测受检者所有相关基因及其突变情况，大大提高了遗传病的诊断效率，已成为临床诊断的重要手段。NGS技术在临床上被广泛应用于包括染色体异常、基因组拷贝数变异、单基因病基因筛查在内的多种胚系遗传病的筛查，并贯穿于生育全周期。本文从生育周期的全过程介绍NGS技术在遗传病筛查中的作用。

1 NGS技术在隐性遗传病携带者孕前筛查中的应用

已有研究结果显示，每人携带0～7个隐性单基因遗传病的致病突变，携带者无任何临床表现，但会将致病突变向下传递；如果女性携带X连锁隐性遗传病，其所孕男性胎儿患遗传病的概率为50%；如果夫妇双方均为常染色体隐性遗传病携带者，所孕胎儿患遗传病的概率为25%。因此，孕前携带者筛查是避免孕育隐性遗传病胎儿的重要手段。传统的携带者筛查主要依赖于Sanger测序，每次只能鉴定1种或几种特定的突变基因，且病种有限位点较少，限制了这种有效预防策略在临床上的普及。NGS技术的读长较短，能同时高精度、高效率、高通量地对DNA分子进行序列测定，对单基因隐性遗传病携带者进行广谱筛查。2011年，Bell等[3]应用NGS技术对104名测试者进行了针对448种隐性遗传病的相关基因测试，结果显示，每位测试者平均携带2或3种严重儿童疾病的突变基因。目前，隐性遗传病孕前筛查主要用于辅助生育技术中供精个体或供卵个体的携带者筛查，以及近亲婚配夫妇的筛查，未来普通低风险夫妇携带者群体将成为主要筛查对象。

2 NGS技术在胚胎植入前产前诊断中的应用

胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是指在辅助生殖技术中，通过对配子或胚胎进行遗传学分析，排除有缺陷的胚胎，选择正常的胚胎植入子宫，从而孕育正常胎儿的诊断方法。早期的诊断方法主要是应用PCR或荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技术对单基因异常或有限的染色体异常进行检测；此后，由于比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)和单核苷酸多态性分析(single nucleotide polymorphisms array，SNP array)等技术的发展，进一步提高了检测分辨率。随着全基因组扩增技术的优化和NGS技术成本的降低，NGS技术开始应用于PGD领域。NGS技术能够高效、精确地筛查出胚胎潜在的染色体异常或者基因突变，选择无异常的胚胎植入母体，从根本上提高“试管婴儿”的妊娠成功率和出生后婴儿的质量[4]。

在体外受精(invitrofertilization, IVF)技术中，染色体非整倍体异常是导致其失败的主要原因。应用NGS技术可分析单细胞水平的染色体拷贝变化，从而准确推断染色体非整倍性改变，且诊断时间<24 h。染色体病携带者在生育时，因产生不平衡配子而导致反复流产、生育力下降、畸形儿出生等，在PGD中应用NGS技术不仅能有效检测目标易位相关染色体，也能检测其他染色体异常。目前，应用NGS技术进行染色体病诊断的适应证主要为罗氏易位携带者、大片段相互易位携带者、倒位携带者等。有研究[5]结果显示，相较于目前临床常用的SNP array，NGS技术对某些区域(如性染色体等)异常的诊断准确率更高。

对于符合孟德尔遗传规律的单基因病个体，提取囊胚滋养外层细胞DNA，通过靶向NGS技术和全基因组连锁分析确定囊胚中目的基因的拷贝数，选择包含最少拷贝数基因突变的囊胚进行移植。目前已有研究[6]成功地将PGD应用于包括甲基丙二酸血症、X-连锁肾上腺皮质发育不良、血友病A等在内的单基因病的诊断。最近的研究[7]发现，在囊胚腔液和培养过囊胚的废培养基中依然存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)，该环境中cffDNA的发现有望替代传统的有创胚胎活组织检查，作为一种无创的检测材料应用于单基因遗传病的PGD中。

3 NGS技术在基于母体血浆中cffDNA的无创产前筛查中的应用

3.1 胎儿染色体非整倍体异常 以唐氏综合征为主的胎儿染色体非整倍体异常是胎儿产前筛查的主要疾病。传统的产前筛查主要为唐氏血清学筛查，通过在孕早期或孕中期测定妊娠相关血浆蛋白A、β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)、AFP、游离雌三醇(uncojugated estriol 3，uE3)等水平，结合孕妇的年龄、孕周、体重等计算胎儿罹患某一遗传疾病的风险率。然而该筛查方法的精度不高，且漏诊率高。于孕早、中期穿刺获取胎儿的绒毛、羊水或脐血等进行染色体核型分析[8]的方法对小的染色体结构异常的分辨率较低，受细胞操作培养的限制，成功率易受细胞污染、气候环境等多种因素的影响，且耗时较长。

1997年，Lo等[9]在母体血液中发现cffDNA。2008年该团队结合大规模平行测序技术测定母体血液中总游离DNA的片段，成功鉴定出21三体综合征后，以NGS为主的无创产前诊断技术因具有安全性好、高通量和特异度高的优点在临床上普及。该方法首先应用于胎儿染色体非整倍体的筛查，利用基于大规模平行高通量测序技术检测母体血浆中cffDNA序列，量化DNA片段，通过生物信息分析，对cffDNA的碱基序列进行识别、判断，据此计算出源于胎儿目标染色体(21/18/13)的cffDNA基因量是否增加，从而推断胎儿是否患有染色体非整倍体异常。

3.2 胎儿染色体微缺失和微重复 与染色体非整倍体一样，染色体亚结构异常(微缺失和微重复)也会导致胎儿的身体或智力发育严重异常。有研究[10]报道，致病性染色体微缺失和微重复的发生率可能接近于唐氏综合征。此外，在大约6%的B超结果异常和1.7%的高龄或唐氏综合征筛查阳性的孕妇中存在染色体微缺失和微重复，且其发生率与孕妇年龄无明显相关性[11-12]。因此，对所有年龄段孕妇均应在产前行胎儿染色体微缺失和微重复检测。

随着无创产前检查(non-invasive prenatal testing，NIPT)技术在全球超过60多个国家和地区临床工作中的推广应用，以及相关临床研究的深入，使其检测范围进一步扩大。自2013年起，国际知名的NIPT服务商Natera、Sequenom、Illumina等公司陆续推出针对染色体拷贝数异常(copy-number variants，CNVs)的检测服务，称为NIPT-Plus技术。NIPT-Plus技术在经典NIPT技术基础上升级测序流程,增加测序深度，同样依托于传统的NGS基因测序仪、配套的快速建库核心技术和快速分析流程，主要依赖于全基因组低深度测序。

有学者应用NIPT-Plus技术对94 085名单胎妊娠的妇女进行前瞻性临床样本研究，成功地检测出965例染色体非整倍体和163例染色体微缺失微重复综合征[13]。该方法实现了从染色体非整倍体至微缺失和微重复NIPT的飞跃，可覆盖90%以上的染色体病，是迄今国际上涵盖疾病种类最多、检测精度最高的NIPT方法。值得注意的是，目前临床上仍缺乏系统解读CNVs结果的数据库，NGS技术应用于CNVs的检测会发现大量的“临床意义不明确变异”(variants of uncertain significance，VOUS)结果，给患者和遗传咨询医师带来很多挑战。

3.3 胎儿单基因病 NGS技术除了能够应用于产前染色体异常检测之外，也能进行产前单基因遗传病的检测。对于常染色体显性遗传病，通过检测孕妇的血浆cffDNA有无携带致病位点(父源突变、新发突变)来判断胎儿是否发病[14]；对于常染色体隐性遗传病也具有提示作用，若父母同时携带不同的杂合突变(先证者为复合杂合突变)，只有在孕妇外周血中检测到父源突变时，才需进一步行侵入性产前诊断，使进行有创产前诊断的孕妇减少了50%[15]。若父母携带相同致病杂合突变，通过大规模平行测序或数字PCR技术等精确定量cffDNA浓度，以此来分辨突变来自父源或母源[16]。除了cffDNA，母体血液循环中的游离胎儿细胞[17]和子宫颈黏液中胎儿脱落的绒毛细胞[18]检测联合NGS技术已被成功地应用于单基因遗传病的无创产前诊断。

目前基于NIPT的无创产前诊断技术已成功地应用于杜氏肌营养不良症[19]、脊髓性肌萎缩症[20]、先天性肾上腺皮质增生症[21]、囊性纤维化[22]、新生儿糖尿病[23]、软骨发育不全[14]、苯丙酮尿症[24]等单基因遗传病的产前检测，NIPT检测单基因遗传病的应用进展已有综述[25]详细介绍。

基于cffDNA的高通量测序的NIPT技术的发展，正在迅速改变传统的产前诊断和产前筛查手段，并在临床试验中得以证实。NIPT技术检测染色体微重复和微缺失目前尚存争议，但美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)仍建议NIPT可作为孕9～10周且BMI<40 kg/m2孕妇检出21三体、18三体和13三体染色体非整倍体异常胎儿的一线常规筛查技术[26]，也可对一些常见的染色体微缺失微重复综合征进行检测。然而，该方法作为一种筛查手段存在局限性，高风险孕妇须采用经典的羊水胎儿细胞染色体核型分析或者染色体微阵列分析等确诊；且因受胎盘嵌合、母体状况、孕周等因素影响，易产生假阳性和假阴性等异常结果。

4 NGS技术在出生后单基因遗传病诊断中的应用

已知的单基因病致病基因和遗传方式大部分已明确，不受环境因素的影响。目前，已知的人类单基因遗传病已超过10 000种[27]，尽管单基因病个体发病率很低，但人群总发病率仍较高，约为1/100。大部分单基因病具有致死性、致残性或致畸性，临床表现多样，因此诊断准确率不高。传统的单基因遗传病检测方法主要为Southern印迹法、Sanger测序，以及以PCR技术为基础的各种检测手段[28-33]。传统检测方法的操作步骤复杂、通量低，不易检测出未知的突变位点和进行全基因组范围内的基因突变分析。

通过先进的NGS技术可对上千种由于基因变异(基因突变、平衡异位、微缺失等)导致的遗传病进行检测，且可在早期对胎儿的脱落细胞或者绒毛膜进行检测，在产前就可确认胎儿是否患有遗传病。目前，NGS技术应用于单基因遗传病的形式有目标序列捕获高通量测序技术(Panel)测序、全外显子组测序、全基因组测序和转录组测序等。

Panel测序通过靶向某一已知疾病的全部致病基因，能够快速高效地分析给定样本是否患有该疾病，根据临床诊断需要自由设计Panel，灵活方便，但不能有效地预测新的致病基因和对未知疾病的致病基因进行诊断。当Panel测序诊断结果为阴性，或者临床表型比较复杂时，就需要行全外显子组测序和全基因组测序，以进行更大范围的筛查。全外显子组测序是指对个体外显子区进行测序的方法，一般包括22 000个左右的编码基因[34]，能够更快地确定致病基因及其突变位点，但不能获得完整的基因组信息，且不适用于非编码区突变和DNA结构变异等检测。全基因组测序是对某个体基因组的测序，不仅能够明确患者的基因谱，而且能够检测出更多的突变类型，如一些结构变异、拷贝数变异等；但该方法价格昂贵且数据量大，导致数据储存和结果解读十分困难。全外显子组测序和全基因组测序应用于潜在遗传病(尚未确诊)的分子诊断时，诊断准确率为25%～52%。通过TRIO测序(患者及其父母共同进行测序)，有助于发现父母不存在，而孩子新发生的突变(新发突变)和潜在的隐性遗传突变[35]。转录组测序主要是通过对某一物种特定细胞或组织在某个状态下的转录本和基因序列进行测序，以研究基因的表达情况，从而对非编码区功能、结构和新转录本的预测等进行研究。

5 总 结

受益于研究的不断深入和大规模的应用，临床上二代测序在遗传病筛查方面的进展迅速，新的测序方向如RNA测序数据的集成、结构变异(structural variation，SV)研究、现有二代测序检测层级的选择和策略优化等均迅速开展。然而，NGS技术对遗传病的诊断依然存在局限性。首先，对于单基因病的诊断，受制于测序深度等影响，其结果需经Sanger测序等验证；且NGS技术不能有效地解决一些特殊的单基因病基因突变(如倒位、假基因等)的检测问题。其次，对于染色体异常的诊断，NGS技术不能对拷贝数无改变的结构异常做出判断，不能区分平衡易位携带者与正常胚胎；且由于结构的特殊性，NGS技术不能准确地判断着丝粒和端粒区域的异常。最后，受制于种族差异、数据库和新发突变功能预测等因素制约，对一些NGS的结果进行准确详细的解读比较困难。目前，国内NGS技术的发展面临区域发展存在差异和在基层医院开展困难的问题；但不可否认的是，未来很多疾病的临床NGS都可能被纳入常规检测流程中，而一系列指南的完善和操作流程的建立将进一步推动临床NGS技术的发展，从而不断丰富人类的基因组数据库。