羊水游离RNA研究进展

任建宇，杨树法

首都医科大学附属北京妇产医院，北京100026

随着分子生物学技术的发展，使产前诊断从传统的核型分析、FISH检测以及QF-PCR等低分辨率、低通量的技术进入到染色体微阵列分析技术、全基因组测序以及全外显子测序等高分辨率、高通量的检测技术，更多类型的染色体微缺失/重复、点突变等基因组变异信息被检出。基于现有的科学研究发现，将变异分为致病性、可疑致病性、不确定性、可疑良性以及良性[1～5]。在产前诊断中，致病性不明确变异(包括可疑致病性、不确定性、可疑良性)的检出率为1%～2%[6]。因此，获取更多胎儿发育数据协助临床医生和孕妇判定胎儿发育情况，具有重要临床意义。游离RNA反映了来源细胞的基因表达情况[7，8]，羊水游离RNA(AcfRNA)存在于离心后的羊水上清中，是整个胎儿发育状态的反映。本文将从AcfRNA的来源和存在形式及影响AcfRNA中基因变化的因素等角度探讨羊水游离RNA与胎儿发育的关系。

1 AcfRNA的基因来源与存在形式

1.1 AcfRNA的基因来源 游离核酸是存在于血液、羊水、尿液以及其他体液中的细胞外核酸，来源于凋亡、坏死的细胞，包括游离DNA和游离RNA。游离DNA反映了来源细胞的基因组状态，如来源于肿瘤细胞的游离DNA可用于筛查和诊断肿瘤、预测预后、检测耐药和术后复发等[9～12]。无创产前筛查以孕妇血液中胎儿来源游离DNA(cffDNA)为检测对象，与传统的血清学筛查相比，对染色体非整倍体具有很高的敏感性和特异性[13]。游离RNA反映了来源细胞的基因表达情况[7，8]，AcfRNA存在于离心后的羊水上清中。

AcfRNA来源于胎儿细胞的凋亡和死亡，凋亡细胞释放的RNA可以通过胎儿血液经由肾脏排泄入羊水，皮肤也是RNA进入羊水的重要途径。研究表明，在孕20周前胎儿皮肤尚未角质化，胎儿和羊水间可以通过皮肤进行物质双向交换[14]。另外，胎儿吞咽、肺脏分泌以及胎盘扩散都也是羊水的来源[15]，同样也是AcfRNA的来源之一。

羊水是产前诊断中最常用的胎儿样品，也是能够取到的出生前胎儿最常见的组织或成分。羊水由胎儿脱落细胞和羊水上清构成，脱落细胞以皮肤细胞和尿道脱落细胞为主，而羊水上清来源更广泛。在羊水上清中检测到的基因种类高于脱落细胞[16]，神经组织特异的基因可以在AcfRNA中检测到，却不能在脱落细胞中检测到。与脱落细胞相比，AcfRNA更能准确反映胎儿整体的发育状况，用于研究胎儿发育。

核糖体蛋白、酶类以及转录调节因子是AcfRNA中最常见的蛋白质，这些蛋白质是参与细胞增殖、分化以及凋亡的重要基因[17]。从组织分布来看，脑、肝脏、肾脏、肺、脊髓、血液、卵巢、上皮、舌、胰腺、肾上腺以及甲状腺等多个组织器官的基因均可在AcfRNA中检测到[15，17]，这些基因参与骨骼和肌肉系统、神经系统、造血系统等多个器官系统的发生和发育。人类胚胎和胎儿组织难以获得，导致人类胚胎和胎儿组织的转录组研究较少，寻找其他来源的胎儿转录组已成为研究胎儿发育的重要途径。AcfRNA的发现为研究出生前胎儿转录组提供了很好的材料。

1.2 AcfRNA的存在形式 AcfRNA以不同的形式存在。Larrabee等[18]证实离心后的羊水上清中含有游离RNA，并用不同孔径(0.22、0.45、5 μm)的滤膜对羊水进行过滤，通过逆转录PCR测定过滤后的羊水上清中GAPDH和β-globin的含量，发现过滤能够显著降低GAPDH含量，但不能降低β-globin含量，提示游离RNA可能以游离和囊泡形式存在。2017年，Xie等[19]在CD24和CD9双阳性的外泌体中检测到游离RNA，证实了AcfRNA可以囊泡形式存在。AcfRNA包裹囊泡中，从而保证了游离RNA的稳定。

2 影响AcfRNA中基因变化的因素

2.1 AcfRNA中的基因成分可随孕周发生变化 AcfRNA中基因来源于发育中的胎儿，与胎儿器官的发生密切相关。胎儿的发育过程是一个多器官顺序发育的过程，该过程以组织特异性基因在AcfRNA中变化的形式表现出来。孕早期，AcfRNA中基因高表达神经和内分泌系统基因；孕中期，AcfRNA中可高表达基因集中于小肠、胎盘、子宫等组织器官；孕晚期，AcfRNA中高表达气管、肺、唾液腺、扁桃体、舌头、结肠、骨髓、皮肤等组织器官基因[20，21]。AcfRNA中基因的变化也表现为可变剪接体的变化，随着孕周增长，大脑发育以及免疫相关通路基因的剪接体表达量发生变化。

随着胚胎的发育，胎儿皮肤逐渐发生角质化，血脑屏障逐渐形成。AcfRNA中基因的变化受到皮肤角质化、血脑屏障发育等胎儿屏障结构的影响。在脊髓脊膜膨出胎儿，由于血脑屏障发育缺陷，神经发育和再生相关基因、脊髓脊膜膨出相关基因、轴突引导和生长相关基因呈高表达，这些特异表达在神经组织的基因参与了神经细胞迁移、神经分化、对外应激、轴突生长、突触传递以及细胞内信号传导等多种神经功能[22]。

2.2 胎儿发育异常影响AcfRNA中的基因表达 胎儿发育异常表现为相应器官和组织中基因表达变化的差异，进而表现为AcfRNA中基因的表达变化。因此，AcfRNA中基因的变化与胎儿器官发育异常的机制密切相关。

先天性梗阻性肾病可以导致急性或慢性胎儿肾损伤，出现尿道阻塞和肾盂扩张，导致肾小管上皮细胞死亡。在先天性梗阻性肾病患儿，其胎儿羊水上清外泌体中hsa-miR-299-5p和hsa-miR-300表达量上调，二者的靶基因参与Wnt/β-catenin信号传导通路。Wnt/β-catenin信号传导通路与肾坏死密切相关[23]。

胎儿发育迟缓是指胎儿体质量低于其胎龄平均体质量的第10百分位，其发生与孕期中的胎儿、母体以及环境中的多种因素相关。当胎儿出现发育迟缓时，胎儿AcfRNA中与蛋白合成、生物黏附以及胎盘功能相关的基因表达发生变化，生长和发育必需的信号传导通路受损[24]。

染色体非整倍体是导致胎儿发育异常的常见原因。21三体和18三体可分别导致唐氏综合征和爱德华综合征，这两种综合征均存在神经发育异常和智力障碍。在唐氏综合征和爱德华综合征患儿，其AcfRNA中神经组织特异的基因表达出现变化，部分发生变化的基因富集在神经疾患相关通路上，NEUROD2、SOX11等在神经系统发育过程中起到关键作用的基因发生变化[25～27]。先天性卵巢发育不全症，又称为Turner综合征，是因为缺少一条性染色体导致的。Turner综合征患儿AcfRNA中XIST基因下调，并伴有造血和免疫系统相关基因出现显著变化[28]。XIST基因是女性体内X染色体失活的重要基因，通过X染色体失活保证了女性染色体剂量平衡[29]，与Turner综合征发病机制密切相关。

在双胎输血综合征患儿以及先兆子痫患儿等妊娠期异常时，AcfRNA中的基因也会发生相应变化，这些变化与胎儿的疾病发生密切相关[30，31]。在双胎输血综合征患儿AcfRNA中，心血管系统基因表达异常；在先兆子痫患儿AcfRNA中，细胞运输、信号转到以及体外应激等过程的基因发生异常表达。

综上所述，通过对孕期不同阶段正常胎儿和异常胎儿AcfRNA中基因表达变化的研究，表明AcfRNA含有来源于胎儿多个器官组织的游离RNA，其中某些基因随孕周和胎儿病理状态发生变化，是胎儿发育情况的综合反映。这些变化基因中存在能够特异性反映胎儿发育状态标志性基因，如果能够筛选出反映不同器官和组织发育状态的关键基因，利用这些基因对胎儿发育是否异常做出预测，具有重要临床意义。尤其是在面对产前诊断中可疑性基因突变(拷贝数变异)时，将为临床和孕妇提供重要证据。