右美托咪定对布比卡因致心脏毒性的影响

金周晟 董娇娇 陈鸿飞 夏芳芳

伴随着超声技术的发展，区域神经阻滞在临床手术中应用越来越广泛［1］，但局麻药中毒会引起全身系统性毒性［2］，严重时可引起心律失常甚至心脏停搏等心脏毒性［3-4］。布比卡因是长效酰胺类局麻药之一，因其麻醉效果强且术后镇痛效果好，在临床麻醉中广泛使用，其心脏毒性也是同类酰胺类局麻药中最强的［5］。右美托咪定是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，通过α2-AR抑制神经元放电，发挥抗交感、抗焦虑、镇静和镇痛作用［6］，在区域阻滞麻醉中广泛应用［7-8］。Hanci等［9］研究发现，右美托咪定预处理后能够增强心脏对布比卡因毒性的耐受能力。另一研究发现α2受体激动剂可乐定预处理组发生心脏毒性症状时，血浆内的布比卡因浓度比对照组高了2倍多，而心脏浓度并无差异［10］。可见右美托咪定能增强心脏对布比卡因毒性的耐受性，但其具体机制不明。本文通过建立心肌细胞布比卡因中毒模型，研究右美托咪能增加心脏对布比卡因毒性耐受的效果及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 HCAEC人类冠状动脉内皮细胞来源于美国ATCC细胞库，ECM培养基（美国ScienCell公司），CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂（日本DOJINDO公司），各种抗体，ZO-1、PI3K、p-Akt、Akt、p-PTEN、PTEN，兔抗β-actin多克隆抗体（美国Abcam公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司）。

1.2 细胞培养及分组 HCAEC人类冠状动脉内皮细胞复苏后加入含10%胎牛血清的内皮细胞培养液（endothelial cell medium，ECM）接种于培养瓶，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，待达到细胞生长对数期时分为对照组（细胞不做任何处理）；右美托咪定组（200μg/L右美托咪定作用2h）；布比卡因组（1000μM布比卡因作用2h）；右美托咪定+布比卡因组（右美托咪定和布比卡因作用2h）；右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制剂组［右美托咪定、PI3K抑制剂LY294002（20μM）及布比卡因作用2h］。造模结束后，收集细胞及培养基。采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测细胞活性；蛋白质印迹法（Western Blot，WB） 检 测Z01、PI3K、p-Akt/Akt、p-PTEN/PTEN等蛋白。

1.3 血管通透性测定 使用Transwell聚碳酸酯膜插入物培养内皮细胞，进行内皮细胞通透性检测［11］（Costar Inc.，6.5mm直径，3μm孔隙大小）。在Transwell装置的上室中加入细胞悬液（2×106个细胞）。细胞融合后（通常在播种后24～48h），用无血清培养基代替培养基。上室加入布比卡因或布比卡因/右美托咪定或布比卡因/右美托咪定/PI3K抑制剂LY294002。2h后，提起加入物，并搅拌下室中的培养基。然后用液相色谱/质谱法测定下腔中布比卡因的浓度［12］。在一些实验中，将单层膜与PI3K抑制剂LY294002孵育2h，然后加入布比卡因或右美托咪定。

1.4 Counting Kit-8（CCK-8）法测定细胞活力 用灭菌PBS将孔填满至边缘。共有100μl CCK-8的溶液添加至每个孔，37℃孵化细胞2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。Western blot检测HCAEC人类冠状动脉内皮细胞Z01、PI3K、p-Akt/Akt、p-PTEN/PTEN等血管通透性蛋白相对表达量。造模后，弃去培养基，加入适量的培养细胞总蛋白提取剂及蛋白酶抑制剂（PMSF）（培养细胞总蛋白提取剂：PMSF=100∶1配制）提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度并配置上样蛋白。用SDS-PAGE分离胶10%，浓缩胶5%电泳，之后采用湿法转膜将蛋白转印至0.45μm的PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1h，一抗稀释液配制兔抗ZO-1抗体，兔抗PI3K抗体，兔抗p-Akt抗体，兔抗p-PTEN抗体和β-actin抗体（1∶1000），将膜放入相应一抗液中4℃水平摇床孵育过夜，次日加入1∶5000的山羊抗兔IgG（H+L）HRP室温孵1h，后加入ECL发光液，用凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）自动显影读取条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值，对于磷酸化的条带，用一抗二抗去除液除去原先的一抗和二抗，重新封闭、分别敷兔抗Akt抗体及兔抗PTEN抗体4℃孵化过夜，重复上述后续步骤。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件软件。计量资料以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，采用LSD/Bonferroni进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力评估 HCAEC细胞活力在与组间差异无统计学意义（P=0.738）见表1。

表1 5组细胞活力比较（±s）

表1 5组细胞活力比较（±s）

组别 细胞活力右美托咪定组 0.94±0.04布比卡因组 0.91±0.05右美托咪定+布比卡因组 0.91±0.05右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制剂组 0.93±0.02对照组 0.92±0.05 P值 0.738

2.2 右美托咪定增加人冠状动脉内皮的通透性 与未处理的内皮细胞相比，右美托咪定的加入降低布比卡因在内皮细胞单层的跨内皮运输（P=0.002）。这在加入PI3K抑制剂后逆转。抑制剂组布比卡因浓度高于右美托咪定组（P=0.001）。同时，与布比卡因组相比，差异无统计学意义（P=0.751）。见表2。

表2 2h后Transwell下室中布比卡因浓度［μg/L，（±s）］

表2 2h后Transwell下室中布比卡因浓度［μg/L，（±s）］

组别布比卡因组 36±4右美托咪定+布比卡因组 26±3右美托咪定+布比卡因+PI3K抑制剂组 36±5 P值 0.002

2.3 通透性蛋白ZO-1表达 5组ZO-1蛋白的表达组间差异有统计学意义（P＜0.05）。右美托咪定组和右美托咪定+布比卡因组的ZO-1蛋白表达量高于对照组（P＜0.05），同时右美托咪定组和右美托咪定+布比卡因组ZO-1蛋白表达量高于布比卡因组（P＜0.05）。而布比卡因组与对照组ZO-1的表达量差异无统计学意义（P=0.109）。PI3K抑制剂组ZO-1蛋白表达与对照组表达量差异无统计学意义（P=0.394）。

2.4 通路蛋白表达 5组间PI3K、p-Atk以及PTEN蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。右美托咪定组和右美托咪定+布比卡因组刺激PI3K及p-Atk蛋白表达（P＜0.05），同时布比卡因组并未增加PI3K和p-Atk蛋白表达（P=0.775）。

3 讨论

在本实验中，在布比卡因中毒背景下右美托咪定能激活PI3K/Akt通路，并且增加ZO-1蛋白的表达，降低血管对布比卡因的通透性。ZO-1是1986年发现的与紧密连接（TJ）相关的蛋白［13］。近年来发现其与调节和维持上皮篱笆和屏障功能有关。多数情况下只要ZO-1受到破坏，紧密连接功能多随之变化，故ZO-1通常作为观察各种组织紧密连接屏障功能和通透性功能的指标。

本实验结果显示，右美托咪定可以减少布比卡因透过血管壁的量。提示，右美托咪定能降低血管通透性，从而减少布比卡因从血管分布到脏器的量。同时，本实验结果显示，右美托咪定组与单纯布比卡因组相比，ZO-1蛋白表达显著增加，提示右美托咪定可能通过增加连接蛋白的表达从而降低血管对药物的通透性。即右美托咪定通过增加ZO-1蛋白的表达降低血管通透性，将布比卡因“锁”在血管内，从而增加心脏对布比卡因毒性的耐受性。Shen等［14］在大鼠创伤脑模型中使用右美托咪定后，能通过降低血脑屏障通透性达到脑保护的作用，其可能机制与右美托咪定调节ZO-1蛋白有关。在肾脏缺血再灌注模型研究者得到相同的结果，右美托咪定会增加ZO-1蛋白从而对远隔器官肺起到保护作用［15］。上述的研究结果也印证本实验的结果。

实验研究发现，脑创伤模型抑制PI3K/Akt通路蛋白的表达，抑制ZO-1蛋白的表达［14］。而右美托咪定能逆转这个作用，并且在加入PI3K/Akt通路抑制剂后，该作用消失。该实验结果提示，右美托咪定通过激动PI3K/Akt通路降低血脑屏障通透性实现脑保护作用。Alice等［16］也研究证明，PI3K/Akt通路能增加ZO-1蛋白的表达。上述结果说明，右美托咪定可能通过PI3K/Akt通路调节ZO-1蛋白从而降低血管通透性。在本实验结果显示，右美托咪定激活PI3K/Akt通路。这结果与上述研究结果类似，然后在加入PI3K抑制剂后，右美托咪定对增加ZO-1蛋白表达的作用消失，同时右美托咪对血管通透性的改变作用也消失。这提示，在布比卡因中毒情况下，右美托咪定是通过激活PI3K/Akt通路增加ZO-1蛋白表达从而实现降低血管通透性。

在布比卡因中毒模型中，右美托咪定通过PI3K/Akt通路来调节ZO-1蛋白降低心脏血管通透性，最终增强心脏对布比卡因毒性的耐受性。