某地方品种鸡群鸡白痢沙门氏菌感染状态监测

孔令华

摘  要：为了解某地方品种鸡群沙门氏菌病的流行病学及病原学特征，为防治沙门氏菌提供数据支持。本研究从某地方品种鸡群的胎粪样品、水线乳头和环境拭子共采集105份样品，进行沙门氏菌的分离鉴定。结果显示：共分到25株沙门氏菌，所有采集的样品中沙门氏菌的分离率为23.81%，且分离株均为鸡白痢沙门氏菌。

关键词：沙门氏菌;胎粪;鸡白痢沙门氏菌;地方品种

中图分类号：S858.31    文献标识码：B    文章编号：1673-1085（2020）11-0047-03

沙门氏菌是一种常见的、传播途径广泛的食源性病原菌，可以垂直或水平传播[1]。沙门氏菌病是与兽医公共卫生密切相关的重要的一类人兽共患病。根据病原学特点分为鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒[2]。家禽感染沙门氏菌后会导致生产性能下降、种蛋孵化率降低等，造成严重的经济损失[3]。鸡白痢沙门氏菌对各个品种的鸡均易感，主要感染2～3周龄的雏鸡，流行性高，给养殖业带来了极大的威胁[4]。

本研究通过对某地方品种鸡群采集环境拭子和胎粪样品进行沙门氏菌的分离鉴定，了解和监测该鸡群鸡白痢沙门氏菌的感染状态，同时为种禽场鸡白痢净化工作提供了参考。

1  材料与方法

1.1  试剂  缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸培养基（SC）、四硫磺酸盐煌绿培养基（TTB）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD），均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;2×Taq Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DuRed，购自核酸染料北京泛博生物化学有限公司;酵母提取粉、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，均购自天际时开通化学试剂有限公司;琼脂粉，购自北京索莱宝科技有限公司;琼脂糖，购自南京生兴生物科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  样品的来源  2020年10月从某地方品种鸡场收集环境拭子、水线乳头和胎粪样品共105份，其中环境拭子30份、水线乳头5份及胎粪样品70份。

1.2.2  沙门氏菌的分离鉴定  无菌条件下将环境拭子棉棒放入4.5 mL BPW，水线乳头取500 μL加入4.5 mL BPW混合，称取0.5 g胎粪样品装入到含有4.5 mL BPW灭菌摇管，置于摇床中，37 ℃、220 rpm培养8～12 h。将0.5 mL BPW增菌液分别转入4.5 mL SC和TTB中，37 ℃、220 rpm培养18～24 h。用接种环蘸取TTB和SC增菌液后划线接种于XLD琼脂平板，放置于37 ℃温箱中培养24～48 h。

在XLD平板上挑取3～5个疑似沙门氏菌的黑色或无色透明、光滑圆润单菌落，加入500 μL LB液体培养基增菌6 h。选择沙门氏菌特异性引物FimW确认[5]。引物交由上海生工生物工程股份有限公司合成。使用LB菌液作为模板，扩增体系共25 μL，包括：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（F/R）各1 μL，菌液1 μL，无菌双蒸水9.5 μL。FimW反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。吸取PCR产物8 μL使用1%琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像观察结果。

1.2.3  鸡白痢沙门氏菌PCR鉴定  选取经FimW引物PCR确定为沙门氏菌的阳性样品菌液作为模板，分别使用鸡白痢沙门氏菌特异性引物IpaJ和SEP进行PCR扩增，STN基因引物作为沙门氏菌鉴定通用引物。25 μL反应体系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，F/R各1 μL，菌液1 μL，剩余用无菌双蒸水补齐。IpaJ反应程序为：94 ℃ 10 min（预变性），94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min（延伸），共30个循环，72 ℃ 10 min（延伸），4 ℃保存。SEP和STN反应程序为：95 ℃ 预变性10 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环扩增35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增結束后取8 μL PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像仪进行成像分析。引物序列见表1。

2  结果

2.1  沙门氏菌的分离培养结果  本研究从某地方品种鸡群共采集样品105份，共分离鉴定出25株沙门氏菌，阳性检出率为23.81%，其中从环境拭子中分离到1株沙门氏菌，分离率为3.33%;胎粪样品中分离到24株沙门氏菌，阳性率为34.28%。沙门氏菌分离情况见表2。

2.2  沙门氏菌的培养特性  在XLD琼脂平板上的疑似沙门氏菌呈现为无色透明、饱满、光滑圆润的菌落;在普通的LB平板上呈现出圆润、微隆起、半透明状的菌落。

2.3  PCR鉴定  电泳凝胶成像结果显示：在105个样品中，共检出25个阳性样品;目的片段大小在495 bp左右，PCR扩增结果与目的条带相符合。部分样品PCR鉴定结果见图1。

2.4  鸡白痢沙门氏菌PCR鉴定  鸡白痢沙门氏菌特异性引物IpaJ、SEP和STN凝胶成像，见图2。

如图2所示，在25个沙门氏菌样品中，25株沙门氏菌均为鸡白痢沙门氏菌，其中共检出13个IpaJ阳性样品，IpaJ阳性率为52%;SEP和STN阳性检出率为100%（25/25）。目的条带大小分别为740 bp、573 bp和260 bp，阳性样品特异性条带与目的条带相符合。

3  讨论

鸡沙门氏菌病在我国养鸡行业广泛存在，其危害贯穿整个养殖周期，导致经济效益下降等一系列问题[6]。因此，对沙门氏菌的流行和感染状态进行监测具有十分重要的意义。本研究从环境拭子、水线乳头和胎粪中分离鉴定得到25株沙门氏菌，阳性率为23.81%，高于信素华等人在广西部分鸡场从鸡胚样品中对沙门氏菌13.95%（18/139）的分离率[7]，也高于王迪轩等人从华中地区部分规模化养殖场中采集的3724份样品分离到124株沙门氏菌的阳性率（3.33%）[8]。本研究结果表明，该地方品种鸡群沙门氏菌病流行和污染状态较为严重，了解这一情况对于该鸡群鸡白痢净化工作具有十分重要的指导意义。

鸡白痢是家禽中重要的一类细菌性疾病，主要感染雏鸡，导致种蛋受精率、孵化率降低，严重制约养鸡业的发展。本研究通过鸡白痢沙门氏菌特异性引物PCR鉴定发现，25株沙门氏菌均为鸡白痢沙门氏菌，这一结果与史瑞雅等人在河北部分地区从132份病料样品分离到48株沙门氏菌（36.36%）且鸡白痢沙门氏菌是唯一血清型的结果相似[9]。本研究对25株分离株进行鸡白痢特异性引物IpaJ PCR鉴定发现，共检出13个IpaJ阳性菌株，IpaJ阳性率为52%（13/25），具体原因有待于进一步的研究。

参考文献：

[1]  Bell， R.L.， Jarvis， K.G.， Ottesen， A.R.， et al. Recent and emerging innovations in Salmonella detection： a food and environmental perspective[J]. Microb Biotechnol，2016，9：279-292.

[2]  宿志民，姜洪涛，潘柳婷.鸡沙门氏菌病的鉴定与防治[J].山东畜牧兽医，2019，40（09）：34-35.

[3]  赵玉梅，范玉霞.肉鸡死胚中沙门氏菌的分离及血清学鉴定[J].山东畜牧兽医，2013，34（05）：1-3.

[4]  张晓英.青海部分地区鸡白痢的监测报告[J].青海畜牧兽医杂志，2018，48（02）：28-29.

[5]  张富友，宋艳，崔治中，等.禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化[J].山东畜牧兽医，2019，40（08）：1-4.

[6]  張凌云.鸡场沙门氏菌的分离鉴定及耐药性研究[D].长春：吉林农业大学，2011.

[7]  信素华，陶程琳，张耀东，等.广西地区鸡胚中沙门菌的分离鉴定及耐药性分析[J/OL].中国动物传染病学报，2020.[2020-09-18].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.S.20200426.1110.002.html.

[8]  王迪轩，高东阳，张天姿，等.华中地区鸡源沙门菌分离鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医，2019，46（03）：931-939.

[9]  董永毅，徐步，张笛，等.江苏省部分地区鸡白痢沙门菌血清学调查分析[J].中国家禽，2019，41（21）：78-80.

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