拮抗菌HT-6引起致病疫霉菌体的生理变化

侯宁，申芬，田荟遥，李成斌，孟翠丽，蒋继志

(1. 河北大学 生命科学学院， 河北 保定 071002；2. 邢台医学高等专科学校 基础医学部，河北 邢台 054000)

由致病疫霉 [Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]引起的马铃薯晚疫病是一种毁灭性卵菌病害，被公认为是世界第一大作物病害，一般年份减产20%左右，重病年份减产50%以上，甚至绝产[1].近年来，病菌基因型不断发生改变，新的毒性更强的生理小种类型不断出现，抗药性逐渐增强，马铃薯品种的原有抗性正在丧失，致使马铃薯晚疫病的防治难度逐年加大[2].因此，更加有效地抑制致病疫霉并预防马铃薯晚疫病受到了许多学者的广泛关注[3]，其中在拮抗菌的筛选、鉴定、抑制特性、抑菌物质分离纯化等方面进行了大量研究[4]，但受到拮抗菌抑制后致病疫霉菌体内生理变化的报道却很少[5].本研究室前期也筛选获得了多株对致病疫霉有强烈抑制作用的拮抗菌株[6]，其中HT-6是分离自西藏林芝核桃树叶片的内生细菌，对致病疫霉菌丝生长和孢子囊萌发有很强的抑制作用，明显优于其他拮抗菌[7].本实验在前期已明确HT-6菌株对致病疫霉的持续抑菌特性以及在马铃薯块茎切片上具有显著防病效果的基础上[8]，进一步对受到拮抗菌HT-6抑制后致病疫霉菌体内的部分生理变化进行分析，以期为深入揭示HT-6与致病疫霉的相互作用，尤其是HT-6抑制致病疫霉的生理机制以及挖掘该菌株的生防潜力提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]W101菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HT-6等均为本实验室分离鉴定并保存的菌株；供试培养基主要有黑麦培养基(Rye)(活化培养致病疫霉以及致病疫霉与HT-6菌株的对峙培养)，LB固体培养基(活化培养HT-6)，LB液体培养基(制备HT-6菌液).

1.2 受抑制的致病疫霉菌丝体的收集

在新鲜Rye平板中央接种经过Rye活化培养的致病疫霉菌饼(d=9 mm)，在菌饼两侧2 cm处对称打孔(d=9 mm)，孔内加入按照文献[8]制备的HT-6菌液(100 μL)进行对峙培养，分别用灭过菌的牙签挑取对峙培养3、6、9、12、15 d的致病疫霉菌丝体并称重记录；以在孔中接种等体积LB液体培养基代替HT-6菌液为对照，在相同培养时间段内收集对照的致病疫霉菌丝体，置于-20 ℃冰箱中备用.

1.3 菌丝体内可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉的测定

按照文献[9]所述方法分别用蒽酮比色法测定菌丝体内的可溶性糖，考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白，碘-淀粉比色法测定可溶性淀粉的含量变化.

1.4 菌丝体内3种抗性酶活性的测定

参考朱琳[10]从致病疫霉菌丝体内提取抗性酶的步骤，称取1 g左右致病疫霉菌丝体并将其放入研钵中，加入石英砂和pH 7.8的磷酸盐缓冲液(PBS)充分研磨成匀浆，离心20 min，收集上清液，-20 ℃保存备用.分别测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)以及过氧化物酶(POD)的活性.

1.5 菌丝体细胞质膜电导率的测定

根据文献[9]所述方法测定对峙培养8 d后致病疫霉菌丝体内的电导率，并比较菌丝体加热煮沸前后电导率的变化，评价拮抗菌对致病疫霉菌体的伤害程度；取受到HT-6抑制8 d的致病疫霉菌丝体加入蒸馏水后，室温下用电导仪测定溶液电导率(R1)，以未受抑制的菌体为对照Ⅰ；然后将致病疫霉菌体放入100 ℃沸水浴中煮沸20 min以杀死致病疫霉组织，冷却到室温后再次测定溶液电导率(R2)，未受抑制的菌体为对照Ⅱ，计算致病疫霉细胞质膜的相对透性(用相对电导率表示)以及伤害率.

相对电导率=R1/R2×100%,

伤害率=(处理电导率-对照Ⅰ电导率)/(煮沸电导率-对照Ⅱ电导率)×100 %.

1.6 菌体溶氧量的测定

采用氧电极法[11]测定致病疫霉的溶氧量(即呼吸耗氧量).取受到HT-6抑制8 d的致病疫霉菌丝体，加入PBS(pH 7.2)和质量分数为2%的葡萄糖溶液，搅拌后在密闭环境中测量溶液中的溶氧量(S1)，以致病疫霉菌饼单独培养作为对照，收集菌丝体，测定其溶氧量(S0)，计算拮抗菌HT-6对致病疫霉呼吸代谢的抑制率(IS)：IS=(S0-S1)/S0.

以上实验，每处理3次重复，实验重复3次.

1.7 数据处理

本实验所有数据采用2016版Excel进行编辑处理，并采用统计分析软件 SPSS 17.0 进行单因素方差分析.

2 结果与分析

2.1 可溶性糖含量的变化

拮抗菌HT-6对致病疫霉菌体内可溶性糖的含量有明显影响(图1a)，在分别对峙培养3、6、9、12和15 d后收集的菌丝体中，受抑制组与对照组相比，虽然可溶性糖的含量均呈增加趋势，但受抑制组中可溶性糖的含量增加幅度很小，而对照组中增加幅度很大，两者在每个培养时间段可溶性糖的含量均达到极显著差异(P<0.01)，这说明受拮抗菌HT-6抑制后，致病疫霉菌丝体内可溶性糖的合成受到阻止或分解加速，且在15天时，菌丝体内可溶性糖的质量分数降低了54.93%.

2.2 可溶性蛋白质含量的变化

致病疫霉受HT-6抑制后，体内可溶性蛋白含量的变化如图1b所示，分别对峙培养不同时间后，受抑制组和对照组中菌丝体内的可溶性蛋白的含量均有下降的趋势，其中受抑制组的下降幅度远远大于对照组；在对照组中，培养第6天和第3天相比下降幅度最大，达到极显著差异(P<0.01)，此后略有上升，但变化幅度不大；受抑制组中，自对峙培养的第6天至第15天，菌丝体中的可溶性蛋白含量一直呈显著下降趋势.受抑制组与对照组相比，对峙培养的第3天至第6天，彼此无显著性差异，但在第9天至第15天的不同时间段内，均与对照达到极显著差异(P<0.01).表明致病疫霉受拮抗菌HT-6抑制后，菌丝体内可溶性蛋白质的合成也受到了阻止或分解速度加快，导致菌丝体内可溶性蛋白质的含量远低于对照.

2.3 可溶性淀粉含量的变化

拮抗菌HT-6对致病疫霉体内可溶性淀粉含量的影响如图1c，随对峙培养时间的延长，对照组和受抑制组菌丝体内的可溶性淀粉含量均呈现增加的趋势，但受抑制组中可溶性淀粉含量的增加幅度小于对照组；其中在6、9、12、15 d的对峙培养时间段内，受抑制组与对照组相比，菌丝体内的可溶性淀粉含量均达到极显著差异(P<0.01)，且在15天时菌丝体内可溶性淀粉的质量分数下降了24.37%.推测拮抗菌HT-6对致病疫霉菌丝体内可溶性淀粉的合成也有较强的抑制作用.

a.可溶性糖；b.可溶性蛋白;c.可溶性淀粉. a和c中**显示同一培养时间对照与处理之间的 差异(P<0.01);b中括号外字母显示同一处理不同时间之间的差异，括号内字母显示不同处理在同一时间的差异.图1 受HT-6抑制后致病疫霉体内几种物质含量的变化Fig.1 Change of some compounds in Phytophthora infestans mycelium inhibited by HT-6 strain at different times

2.4 菌丝体内3种抗性酶活性的测定

2.4.1 PAL活性的变化

实验测定了受拮抗菌HT-6抑制后致病疫霉体内PAL活性的变化.由表1可知，受抑制组与对照组中PAL活性随着培养时间的延长均呈上升趋势，也均在培养的第12天达到最高，第15天时酶活有所下降，但总体上受抑制组中的PAL活性远远高于对照组；其中与培养至第3天的PAL活性相比，受抑制组培养至第6天时开始达到极显著差异(P<0.01)，而对照组培养至第9天时才开始达到极显著差异(P<0.01)；此外，在培养相同时间内，受抑制组与对照组之间在第3天时无显著性差异，但从第6天至第15天，彼此之间均有极显著差异(P<0.01).显示拮抗菌HT-6的抑制作用促进了致病疫霉菌丝体内与抗性相关的PAL活性.

2.4.2 PPO活性的变化

致病疫霉受HT-6菌株抑制后，菌丝体内PPO活性的变化趋势(表1)与PAL酶活性的变化趋势相似；随培养时间的延长，受抑制组和对照组中PPO活性均呈先升高后降低的趋势，也均在培养的第12天达到最高，第15天时酶活有所下降，但总体上受抑制组中的PPO活性远远高于对照组；其中与培养至第3天的PPO活性相比，受抑制组培养至第6天时开始达到极显著差异(P<0.01)，而对照组培养至第9天时才开始达到极显著差异；此外，在培养相同时间内，受抑制组与对照组之间在第3天时即达到显著性差异(P<0.05)，从第6天至第15天，彼此之间均有极显著差异(P<0.01).说明拮抗菌HT-6抑制后增加了致病疫霉菌丝体内与抗性相关的PPO活性.

2.4.3 POD活性的变化

不同培养时间段内HT-6对致病疫霉菌丝体内POD活性的影响如表1所示.随培养时间的延长，受抑制组和对照组中POD活性均呈先上升后下降的趋势，其中在第12天时，酶活均达到最高；在受抑制组中，3、6、9、12 d这4个时间段之间相比，菌丝体内的酶活均有极显著差异(P<0.01)，第12天时酶活达到顶峰，15天时有所下降；对照组中POD活性的变化趋势虽与受抑制组相同，培养12 d时酶活达到顶峰，15 d时略有下降，但酶活增加的幅度远远低于受抑制组；受抑制组与对照组相比，在培养的第3天就有显著性差异(P<0.05)，此后的各个培养时间段，两者之间POD酶活均达到极显著差异(P<0.01)，表明HT-6的抑制作用也促进了致病疫霉菌丝体内POD活性的提升.

表1 拮抗菌HT-6抑制不同时间后致病疫霉菌丝体内3种抗性酶活的变化

2.5 HT-6对致病疫霉菌丝体电导率及溶氧量的影响

受拮抗菌HT-6抑制后，致病疫霉菌丝体内的电导率R1为162.77 μS/cm，未受抑制的对照Ⅰ为60.03 μS/cm，两者之间达到极显著差异(P<0.01)；将受抑制组和对照组致病疫霉菌丝体煮沸后，发现两者的电导率值均大幅度上升，其中受抑制的菌体内电导率R2达到573.67 μS/cm，而对照Ⅱ为258.33 μS/cm，两者之间也达到极显著差异(P<0.01)；进一步发现，受HT-6抑制的致病疫霉菌体内的细胞膜通透性(28.37%)明显高于未受抑制的对照组(23.24%)，对细胞质膜的伤害率达到32.58%.此外，拮抗菌HT-6还可使致病疫霉菌丝体内的溶氧量明显降低(47.13%)，与对照组(56.1%)相比达到显著性差异(P<0.05)，对致病疫霉菌体呼吸速率的抑制率达到15.99%，暗示HT-6可降低致病疫霉的呼吸作用.

3 讨论

近年来，由于致病疫霉A2交配型的出现导致新的生理小种不断涌现，引起马铃薯晚疫病再度大规模爆发[12]，同时病菌对化学农药的抗性也逐步增强[13]，而化学农药的过量使用已严重破坏生态环境，因此寻求高效环保的生物防治手段显得十分迫切.许多学者已经筛选出能够强烈抑制致病疫霉菌丝生长和孢子萌发的拮抗菌及其代谢产物，同时还发现大多数拮抗菌或代谢物均能引起病菌菌丝体表面粗糙、分枝过多、内含物分布不均匀或外溢、直角弯曲等畸形[14].但迄今为止对致病疫霉受到抑制以后菌体内生理变化的研究，主要局限于一些化学农药杀菌机理的研究，其中杀菌剂甲霜灵和ZNQ-0317均能强烈抑制致病疫霉菌丝生长和孢子萌发，但两者的作用方式不同，甲霜灵主要抑制病菌蛋白质和RNA的生物合成，对DNA的合成影响较小，同时还引起脂类代谢中磷脂和甘油二酯增加、甘油三酯降低[15]，但ZNQ-0317对病菌蛋白质及DNA合成均无明显抑制作用，主要是使细胞膜电导率增加，提高了细胞膜的透性[16].而对于受拮抗菌或其代谢产物抑制后致病疫霉菌丝体内生理变化的研究还不多见，杨立宾等[11]的研究表明，致病疫霉受哈茨木霉发酵液的乙酸乙酯提取物抑制后，菌体可溶性蛋白含量和保护酶(SOD、CAT、POD)活性以及呼吸速率均显著降低，菌体MDA含量和电导率明显提高，细胞膜被破坏，电解质外露；本研究室朱琳[10]测定了受梨黑斑病菌(Alternariaalternata)和白菜黑斑病菌(A.brassicae)及其两者的复合发酵液以及放线菌NB12、NB11抑制的致病疫霉菌体内POD、PAL和PPO抗性酶的变化，发现3种酶活与对照组相比均显著下降，且病菌受到的抑制程度越强，酶活下降的幅度就越大.

本实验探究了受拮抗菌HT-6抑制后，致病疫霉菌丝体内部分大分子物质含量的变化，发现随对峙培养时间的延长，受抑制的菌丝体内可溶性糖、淀粉和蛋白质的含量均远远低于未受抑制的对照菌丝体，且对峙培养时间越长差异越大，可能拮抗菌HT-6阻止了致病疫霉菌丝体内这些物质的合成或加速了其分解过程，减少了可供致病疫霉生长发育所需的营养物质与能量，造成致病疫霉生长受阻.其中可溶性蛋白质含量的变化与杨立宾等[11]报道哈茨木霉发酵液乙酸乙酯提取物可降低致病疫霉菌体可溶性蛋白含量的报道相一致，也类似于甲霜灵对致病疫霉的作用方式[15]，但与ZNQ-0317对致病疫霉蛋白质合成无明显抑制作用的结果不同[16]，推测HT-6菌株与ZNQ-0317杀菌剂抑制致病疫霉的活性物质可能不同，也可能是测定时间不同的缘故，ZNQ-0317对病菌蛋白质合成的影响是在处理后48 h测定的结果，而本实验在对峙培养的第3天至第6天，也发现对照与处理之间可溶性蛋白质的含量并无显著性差异，当连续对峙培养9 d时彼此之间才有极显著差异.此外，本实验研究发现在致病疫霉与HT-6对峙培养过程中，随对峙培养时间的延长，受抑制的菌体中PAL、PPO和POD这3种酶活均远远高于未受抑制的对照菌体，这一结果与杨立宾等[11]哈茨木霉乙酸乙酯提取物降低菌体保护酶(SOD、CAT、POD)活性，以及本研究室朱琳[10]报道受拮抗菌梨黑斑病菌、白菜黑斑病菌及其两者的复合发酵液以及NB12、NB11抑制后致病疫霉POD、PAL和PPO活性显著下降的结果均不一致.这可能有以下几方面的原因：一是所用拮抗菌菌株不同，哈茨木霉、梨黑斑病菌、白菜黑斑病菌及其两者的复合发酵液以及放线菌NB12、NB11和细菌HT-6之间抑制致病疫霉的活性物质可能有较大差异；二是测定酶活的时间不同，本实验测定的是致病疫霉与拮抗菌连续对峙培养3～15 d的酶活，杨立宾等[11]测定的是将致病疫霉与哈茨木霉乙酸乙酯提取物混合处理48 h后的SOD、CAT、POD酶活，而朱琳[10]测定的是受到拮抗菌发酵液显著抑制后的致病疫霉菌体转接在新鲜Rye上恢复生长8 d后的酶活，推测恢复生长阶段的菌体刚脱离拮抗菌发酵液的抑制作用不久，一方面不需要产生大量抗性酶，另一方面由于前期在抵抗拮抗菌发酵液抑制过程中已产生并消耗了大量的抗性酶，因此菌体内的抗性相关酶活总体上减少了许多，甚至低于对照菌株.再一方面是测定的酶活种类不完全一致.更为重要的是生物体内与抗性相关酶活的提高往往是生物体适应逆境环境条件的重要表现，甚至被作为生物体抵抗逆境条件能力强弱的评价指标之一.本实验中这3种酶是生物体内常见的与抗性相关的酶，这些酶活升高表明随着与HT-6对峙培养延长或受HT-6抑制时间延长，致病疫霉菌体对HT-6的抑制有逐渐适应并且其抵抗HT-6的能力也有渐渐增强的潜力，这是否类似于病菌的抗药性，有待进一步研究明确.此外，实验还明确了拮抗菌HT-6能够显著提高致病疫霉菌丝体的电导率并大幅度降低菌体溶氧量，说明HT-6菌株增加了致病疫霉菌丝体细胞膜的通透性，并降低了菌丝体的呼吸速率.

由以上研究结果可以看出，不同拮抗菌或其代谢产物，在抑制致病疫霉菌丝生长和孢子萌发的过程中，均会影响病菌体内一些重要的活性物质或抗性相关酶活的变化，只是不同的拮抗菌可能发挥作用的阶段不同或作用强度不同，而对受拮抗菌抑制后病菌体内生理生化变化的深入研究，不仅有助于揭示拮抗菌与病菌之间的相互作用机理，更能为高效利用拮抗菌及其产物防治病害提供实验依据.