非编码RNA在骨代谢及骨重建中作用的研究进展

黄竹 杨岚 江千舟 郭吕华

广州医科大学附属口腔医院，广州口腔疾病研究所，广州医科大学口腔医学重点实验室（广州510140）

随着二代深度测序等新技术的不断发展，研究发现大部分人类基因组被转录成RNA，但这其中只有不到2%的RNA序列进行蛋白质的编码，剩余的大部分RNA序列并不参与蛋白质的编码，被称为非编码 RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）［1］，这表明非编码RNA占了RNA的绝大部分，了解其主要功能和作用机制才能更深入理解机体的病理生理状态。非编码RNA通过募集表观遗传调节因子或转录因子来激活或沉默转录过程，在细胞活动中发挥重要的调节作用［2］。ncRNAs广泛参与机体的生长发育过程，并与各种疾病的发生发展密切相关，而近年的研究发现，ncRNAs与骨改建、成骨分化以及骨代谢相关疾病密切相关［3-5］。了解非编码RNA在骨代谢和骨修复重建中的作用机制，有助于探明骨相关疾病的发病机理，为骨相关疾病的临床治疗提供理论基础。本文通过对几种常见非编码RNA调节相应骨细胞，促进成骨分化的相关研究进行综述，阐明非编码RNA在骨修复重建及骨相关疾病中的研究进展。

1 非编码RNA家族

不编码蛋白的RNA家族根据功能可分为两大家族：管家非编码RNA（housekeeping noncoding RNAs）和调控性非编码RNA（regulatory noncoding RNAs）。其中管家非编码RNA包括了转运RNA（tRNAs），核糖体RNA（rRNAs）和胞质小RNA（small cytoplasmic RNAs，scRNAs）。管家 ncRNA 在转录翻译的过程中多个环节起作用，是蛋白表达不可或缺的组成部分；而调控性非编码RNA是随着各种基因技术的发展才逐渐步入人们视线的新发现的RNA类型。大量的研究显示这一类RNA在几乎所有生物活动中发挥作用，是生物体RNA的重要组成部分。调控性非编码RNA根据长度可分为两类：分为短链非编码RNA和长链非编码RNA。其中短链非编码RNA是由少于200核苷酸组成，主要包括小干扰RNA（small interfering RNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及PIWI相互作用RNA（piRNAs），目前研究较为广泛的是miRNAs。据估计，人类基因组编码超过1 800种miRNAs。而长度＞200核苷酸的RNA成为长链非编码RNA。近年来，还出现一种带有环形结构的环状RNA。微小RNA，长链非编码RNA，和环状RNA是目前研究较为广泛的几种ncRNAs。

1.1 微小 RNA（micro RNAs，miRNAs） 微小RNA是一类存在于所有真核细胞中，长度约为20～22核苷酸的茎环状内源性小RNA，大多位于非编码区内。miRNA通过结合序列互补配对信使RNA转录本的3′-UTR端，能有效降低靶基因的表达水平，负向调控蛋白的表达［6］。miRNA对蛋白的负向调控作用通过以下3种机制来实现：（1）RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）对互补区域的信使RNA进行切割和降解是其主要的作用机制；（2）与信使RNA结合和去稳定化；（3）降低核糖体翻译的效率［7］。人类基因组编码着大约1 800种miRNAs，并且接近三分之二的编码蛋白的基因拥有miRNA的结合位点［8］。miRNAs在骨的形成和代谢中发挥重要作用，如miR-21、miR-31、miR-155等miRNAs在破骨细胞形成或发挥作用过程中高表达而被广泛研究［9］。

1.2 长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs） lncRNAs可分为5种，反义长非编码RNA（antisense lncRNAs）、内含子非编码 RNA（intronic transcriptlncRNAs）、lincRNA（large intergenic noncoding RNAs）、启动子相关lncRNA（promoter-associated lncRNAs）、非非翻译区 lncRNA（UTR associated lncRNAs）。lncRNAs不直接参与蛋白的编码，而是通过多种机制参与蛋白调控，如组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质重构、作为竞争内源性RNA（ceRNA，competing endogenous RNA）、参与mRNA稳定化和支架蛋白的募集等［5］。由于lncRNAs分子结构的灵活性，lncRNAs既能通过碱基互补配对结合RNA，又能形成二级结构甚至三级结构等多种折叠构象结合蛋白，影响转录和转录后的基因表达，使lncRNAs形成可调节DNA、RNA分子和蛋白复合体的广泛调节网络［10］。

1.3 环状RNA（circular RNAs，circRNAs） 20世纪70年代末首次在真核细胞中发现circ RNA，它是一类广泛存在于真核细胞内的非编码RNA（Non-coding RNAs）。与常规线性RNA不同，环状RNA以连续共价闭合环的特殊结构取代线性RNA分子3′-帽子结构以及5′-多聚核苷酸末端结构，使环状RNA具有更高的稳定性和保守性。随着现代基因研究技术的发展，大量证据［11］表明circRNAs并非是错误剪接的产物，而是在生物体内发挥着重要的作用，并与人类疾病的发生发展有着紧密的关联。环状RNA通过调控基因的转录、翻译、拼接等关键步骤介导多种疾病的发生发展过程。circRNAs主要的作用是其本身存在大量miRNA结合位点，可以通过“海绵吸附”机制诱捕miRNA，从而调节靶基因翻译。此外，它可以作为调控因子在转录水平对亲本基因进行调控，它还可以直接对蛋白进行调控，协调蛋白与蛋白之间的关系［11］。随着研究的不断深入，发现环状RNA与骨相关疾病发生关系密切，如骨肉瘤的发生［12］。

2 非编码RNA对骨代谢以及骨修复再生的影响

人体正常骨组织维持在一个动态平衡中，骨重建是一个终身的过程，是新骨组织形成和成熟骨组织再吸收之间动态平衡的过程［13］。成骨和破骨两个过程不断进行，并达到一定的平衡和稳定。ncRNAs作为人类基因组的大部组成部分，在胚胎骨骼发育以及成熟骨组织种都发挥重要作用，影响着骨骼内外各种相关细胞的生长、分化以及凋亡等各项生理活动［4-5，14］。

2.1 ncRNAs对成骨细胞（osteoblast）破骨细胞（osteoclast）的作用 目前已有多个研究证明多种ncRNAs在成骨分化过程中起着重要的调节作用。成骨细胞是来自间充质干细胞（MSC）系的分化细胞。CHONG等［15］通过对MACF1沉默的前成骨细胞测序分析筛选得到lncRNA AK016739，并证明lncRNA AK016739通过抑制转录因子RUNX2和TCF7/LEF1来抑制骨的成骨细胞分化和骨的生成。QIAN等［16］用BMP2处理过的MC3T3-E1细胞，158个环状RNA的表达发生改变，其中有74个上调和84个下调，其中hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和hsa_circ_0010042显著上调。破骨细胞来源于由多能造血干细胞产生的单核-巨噬细胞前体细胞，主要介导骨组织的吸收。破骨细胞在形成过程中，多个miRNAs发挥作用，其中miRNA-21是迄今为止鉴定最为广泛的促破骨细胞生成的miRNA 之一［17］。CAI等［18］通过将载 miR-214沉默抑制剂的纳米材料，冻干后溶解静脉注射入卵巢摘除小鼠体内，发现骨吸收程度较阴性对照组降低，经证实是miR-214通过减弱破骨细胞的活动起作用。

2.2 ncRNAs对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的作用 骨髓间充质干细胞（bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，在骨组织工程中起着重要的作用。研究表明在骨修复重建过程中，BMSCs的多种ncRNAs会发生不同程度的改变。ZHANG等［19］对成骨诱导分化处理后的hBMSCs进行编码和非编码转录本表达的功能网络分析和生物信息学分析，发现了6种核心的调控 lncRNAs（XR_111050、NR_024031、FR374455、FR401275、ER406817和 FR148647），并且进一步验证lncRNA（XR_111050）可增强MSCs的成骨分化。REN等［20］通过CGRP刺激小鼠BMSCs细胞进行成骨诱导处理后进行基因芯片测序发现58个差异表达的circRNAs，其中44个下调，14个上调并验证mmu_circRNA_003795在成骨诱导过程中显著上调，说明环状RNA在BMSCs在成骨分化过程中发挥重要的作用。XIAO等［21］的实验研究结果表明，miR-483-3p通过靶向STAT1来增强RUNX2的转录活性，从而促进BMSCs的成骨分化，由此确定miR-483-3p在成骨诱导中的作用，并提示miR-483-3p为治疗骨质疏松症的新型潜在治疗靶标。

2.3 ncRNAs对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的作用 PDLSCs具有自我更新能力以及多向分化潜能，特别是成骨向分化潜能。LIU等［22］使用R语言筛选出人的牙周炎牙周膜组织与健康牙周膜组织之间差异表达的lncRNAs和mRNAs。结果显示，与健康样本相比，牙周炎样品中的LncRNA MEG3和LncRNA IGF1的表达降低，而miR-27a-3p的表达则升高。实验证明过表达MEG3可升高IGF1的表达从而抑制miRNA-27a-3p来促进成骨分化。ALP和ARS染色的结果表明，lncRNA MEG3或IGF1的上调促进了PDLSCs的成骨分化，而miRNA-27a-3p的上调则可以抑制成骨。在牙周炎患者中，MEG3的表达下调并通过miR-27a3p/IGF轴抑制了PDLSCs的成骨分化。另外，通过微阵列分析发现，miRNAs也参与到PDLSCs成骨向分化的过程中［23］。

3 非编码RNA与骨相关疾病的关系

临床上，正常的骨结构处于由成骨过程和破骨过程相协调的动态平衡过程，一旦这个平衡被打破，就引起一系列的骨相关疾病等病理现象。骨关节炎、牙周炎、骨质疏松等被认为是与骨破坏相关的疾病。ncRNAs与这些骨相关疾病的发生发展密切相关［4-5，14］。

3.1 骨关节炎（osteoarthritis，OA） OA是以关节软骨的退变及损伤为病理特征的慢性疾病，其病理特点为关节软骨磨损退变，关节边缘和软骨下骨反应性增生，骨赘形成。临床表现为膝关节功能异常。XING等［24］骨关节病组织与正常组织相比，有121个IncRNA表达异常，其中上调的73个，下调的48个。六种 lncRNAs（HOTAIR，GAS5，PMS2L2，RP11-445H22.4，H19和CTD-2574D22.4）的表达在OA软骨中上调，可能是通过增加MMP-9，MMP-13，BMP-2和ADAMTS5表达来调节的。IncRNAs可以通过甲基化或乙酰化对组蛋白进行修饰，进而调节基因的转录活性。若充分利用IncRNAs的表观遗传干预能力，可进行基因的靶向治疗，甚至可能研发出一些靶向治疗的药物。

3.2 骨质疏松 骨质疏松（osteoporosis）是随着年龄增大，人群发病率增高，以皮质骨变薄，微结构受损，骨小梁数量下降为特征，使骨骼易患骨脆性和骨折的风险增高的一种全身骨代谢障碍性疾病［24］。许多研究证明骨质疏松与miRNAs调节有关。最近的研究表明，在骨质疏松性骨折患者的血清中有几种miRNA的表达显着上调，并且可以影响成骨分化［17］。CHENG 等［25］检测骨质疏松患者的血清发现miRNA-365a-3p的表达显著升高，通过预测网站miRanda预测并进行双荧光素酶报告基因实验验证了miRNA-365a-3与靶基因RUNX2的结合，下调miRNA-365a-3的表达能显著降低成骨相关基因（OCN、OPN、collagen I）的表达。LI等［26］在绝经后骨质疏松症患者的血清中检测到miR-133a上调，这个结果与患者的腰骨矿物质密度（BMD）呈负相关。经证明，在体外敲除miR-133a可以抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，在体内可以减轻去卵巢大鼠的骨质流失。目前有关骨质疏松的基因研究，大部分聚焦于miRNAs，而lncRNAs和circRNAs在骨质疏松这方面的研究目前较少［27-28］。越来越多的证据表明miRNAs在调节骨稳态中起着关键作用。

3.3 骨肉瘤 在骨肿瘤发生和发展中circRNAs的表达水平失调已被证实扮演着极为重要的角色［29］。研究发现在人骨肉瘤组织中circUBAP2的表达显著升高，并证实其是通过抑制miR-143的表达，上调Bcl-2的表达水平，提示circUBAP2在骨肉瘤的诊断治疗和预后预测存在巨大潜力［30］。lncRNAs在骨肉瘤中也差异表达。有研究证明在骨肉瘤组织中，MiR-200s表达下调，与骨肉瘤组织中的lncRNA ZEB1-AS1和靶基因ZEB1表达水平负相关，上调lncRNA ZEB1-AS1可海绵吸附MiR-200s，从而使ZEB1表达水平上调。lncRNA ZEB1-AS1下调和miR-200s过表达的组合显着抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移［31］。circRNAs和lncRNAs在骨肉瘤中通过miRNAs发挥作用，对于骨肉瘤疾病的诊断及预后预测都有着重要的影响。

3.4 牙周炎 牙周炎是多因素引起的牙周组织进行性丧失的慢性疾病，除了微生物的作用，也可通过基因和表观遗传学因素调节牙周病原体诱导的宿主炎症反应来影响牙周炎的进展［32］。LI等［33］利用生物信息学分析的方法对多个牙周炎样本测序芯片数据结果进行分析发现，6个信使RNA（mRNAs）（HSPA4L、PANK3、YOD1、CTNNBIP1、EVI2B、ITGAL），3个 miRNAs（hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-200a、hsa-miR-142-3p）和 3个 lncRNAs（MALAT1、TUG1、FGD5-AS1）可能参与到牙周炎发病过程与lncRNA相关的内源性竞争网络中。WANG等［34］对牙周炎患者与健康人的血液样本进行检测发现，牙周炎患者在治疗前lncRNA AWPPH在血液中的表达水平明显高于健康人，在接受治疗后，lncRNA AWPPH表达水平降低。在对这些患者进行跟踪随访的时候，发现lncRNA AWPPH的水平与牙周炎复发情况呈正相关关系，高表达水平的lncRNA AWPPH可预测牙周炎的复发。牙周炎的发生发展与lncRNAs的调控有关。

4 总结与展望

非编码RNA是人体内重要的调控分子，在机体的病理生理状态发生发展过程中起着重要的作用。目前骨关联疾病的病因和发病机制尚未阐明。在健康成熟的机体中，骨组织不断进行的骨改建是在破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成处于动态平衡中进行的，一旦这个平衡被破坏，就会引起病理性骨的动态改建，而非编码RNA在这个过程中扮演重要角色。

其中，相比于lncRNAs和circRNAs的海绵吸附作用间接调控靶基因，miRNAs对于靶基因的调控更为直接。miRNAs通过其特异性靶点和靶点介导的下游通路发挥作用。不同的miRNAs针对不同的基因。同一miRNA调控的靶基因往往因细胞和组织类型的不同而不同。即使在相同的细胞类型中，相同的miRNA目标靶点在不同的应激或疾病环境下也可能不同，这可能是由于不同条件下的基因表达和调控谱不同造成的。这说明miRNAs靶向基因调控具有高度特异性，对环境变化十分敏感。因此，在研究miRNAs在骨代谢疾病中的作用时，可针对不同人群、环境等条件对疾病加以区分研究。此外，同样的生物过程，如破骨细胞分化，可以由多个miRNAs调控，其功能可能相互叠加，也可能相互补偿。由此可见，在骨相关代谢疾病临床前开发和临床试验中，考虑特定miRNA靶向不同靶点的潜在副作用是非常重要的。

另一方面，在成骨相关研究中，circRNAs、lncRNAs研究较多的是它们的海绵吸附作用，它们能够隔离miRNA并阻止其与mRNA靶点的结合。这些都增加了骨重建、骨代谢过程中基因调控的复杂性。尽管有研究表明它们还可以通过对靶基因的直接调控起作用，如circRNAs可作为内部核糖体进入位点的序列来促进起始因子或核糖体与可翻译的circRNA直接结合［35］。但目前在成骨机制研究方面，circRNAs及lncRNAs直接调控靶基因的研究尚不充分［36］，因此，后续研究可以从这方面深入。

在促进成骨的环境或破骨的环境中，对于miRNA-mRNA和miRNA-ceRNA甚至是lncRNA-mRNA或circRNA-mRNA网络的理解，对于有关非编码RNA在骨代谢及骨再生相关调控机制的研究将有助于临床上多种骨关联疾病的发生发展机制的研究。由于miRNA分子靶向基因对环境敏感的特异性，以及ceRNA网络的多样性，增加了机制研究的复杂性，但也为研究提供了更多的机会与可能，为骨关联疾病治疗提供了方向。