病证结合动物模型研究进展＊

彭紫凝 ，邢玉凤 ，庞欣欣 ，张雅歌 ，石秀杰 ，韩佳瑞 ，

（1. 河南中医药大学第二临床医学院 郑州 450046；2. 河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院 郑州450002）

在现代医学的研究中，需要通过动物实验来验证临床思路、探索新颖的治疗方法，而动物模型是完整的动物实验中不可或缺的重要基础[1-2]。目前，研究者所建立的大部分动物模型仅以西医的疾病模型为主要参考，整个研究过程中医理论指导与中医证候因素均不能够很好的体现[1]。而换一种方案，建立单纯的中医证候模型只是简单的借鉴中医药的理论方法，一个“证”又对应的不止一种疾病，对模型的建立不具有特异性，且重复性较差[3]。因此，迫切需要一种不仅能反映“病”而且能体现出“证”的动物模型，许多研究者就这一问题进行深入研究，提出了病证结合的动物模型的概念。

病证结合动物模型的建立，是将现代医学科学中，西医所确定的疾病复制在动物身上，同时利用中医理论指导，将中医的证候复制到动物模型上，使研究的模型既具有了西医疾病特点，又具有了中医证候特点，比单纯疾病模型或者单纯证候模型具有更强的说服力，从而使医学科学研究更具有针对性，更好地将微观与宏观、抽象与具体整合[4]。随着现代医学对病证结合动物模型的研究不断深入，取得了相当多的研究成果，本研究就近年来关于病证结合动物模型的研究成果进展进行综述。

1 关于病证结合动物模型的构建要点

构建病证结合动物模型：第一，应重视中医理论指导，模型应充分体现中医理论对研究方向的疾病和证候的影响，如外伤血瘀证动物模型，其原理是根据《黄帝内经》“若有所堕坠、恶疝，在内而不去……则气血凝结”的论述，应用杠杆挤压法，构建外伤血瘀证模型[5]。第二，疾病模型与证候之间应当密切关联，如糖尿病肾病与气阴两虚证密切相关，脑卒中最常见气虚血瘀证，类风湿关节炎最易建立风寒湿痹证，等等。第三，根据研究疾病的不同，应选择最合适的动物，即与人体疾病变化规律尽可能相似的动物，如与内分泌失调有关的疾病的研究，常选用大鼠，因为较其他动物而言，大鼠内分泌腺最容易摘除；由于兔子容易产生发热的反应，最方便制作有关发热的动物模型等[4]。第四，要选择特异性强、重现性好、定量或半定量的指标作为造模评价标准，以挖掘动物身上带有符合中医临床辨证诊断标准的特征。如制备冠心病的寒凝心脉证动物模型，可通过观察大鼠体征，配合心脏彩超、血液流变学等指标来判定。下文将举例说明几种近年来研究较多且疾病发病率较高的病证结合动物模型。

1.1 糖尿病肾病病证结合的动物模型

糖尿病肾病是临床常见的代谢性疾病，是终末期肾病的重要原因，大约35%～40%的1 型或2 型糖尿病患者会发展为糖尿病肾病，增加了心血管疾病的发病率和死亡率[6]。现阶段,西医治疗糖尿病肾病大多是在饮食调整的基础上,采用降糖降压、调节代谢紊乱等一系列治疗方法,疗效一般。中医认为，糖尿病肾病属于“消渴”“水肿”等范畴，其多气虚、血瘀、阴虚、阳虚、湿浊等证型[7]，辨证施治与西医治疗结合可取得较好临床疗效。因此，构建良好的病证结合动物模型对中西医结合治疗糖尿病肾病的研究必不可少。

目前，研究者制备糖尿病肾病动物模型，往往是通过予以大鼠高脂饲料和小剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ），成功制备2 型糖尿病肾病模型。胡爱民等[8]制备2 型糖尿病肾病模型后，采用饥饱失常、过度疲劳、恒温水槽中游泳、惊吓等方法制备气阴两虚证型，通过大鼠行为表现、肾脏病理变化、体液检验及中药反证法来验证制备成功。孙红旭等[9]成功诱导糖尿病肾病模型后，再给予大鼠腺嘌呤和苦寒中药混合灌服，制备脾肾阳虚的中医证型，通过大鼠行为表现、肾脏病理变化、体液检验来证实成功制备模型。樊少仪等[10]制备动物模型符合糖尿病肾病制备的标准后，通过疲劳游泳法制备气虚型糖尿病肾病病证结合模型，主要通过大鼠行为表现、肾脏病理变化、体液检验及游泳时间来验证制备成功。从上述研究结果表明，临床上，糖尿病肾病的证候较为复杂，多虚实夹杂,而已有的病证结合模型仍较为单一，建立证候模型理论依据不够充分，验证证候模型没有相应的理化指标检测，干预药物没有统一标准，评价行为表现尚未统一，等等，这些问题仍然需要进一步研究来解决。

1.2 冠心病病证结合的动物模型

目前，我国因心血管病死亡人数占总死亡人数的40%，死亡率远超于其他疾病，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）人数已经高达1100 万[11]。随着社会发展和人们生活方式的变化，冠心病逐渐成为威胁人类健康的重大疾病之一[12]。虽然现代医学在冠心病的二级预防、冠状动脉旁路移植术等治疗方法上已经取得显著进展，但是仍然存在很多问题，如介入术后胸闷胸痛症状仍明显，部分人对冠心病二级预防的药物不耐受等，中医药治疗则可以很好的缓解以上症状[13]。因此，针对冠心病的中西医结合治疗已经刻不容缓，而科学的建立病证结合的动物模型也是进一步研究冠心病治疗方法的关键。

王朔等[14]采用冠状动脉左前降支结扎法联合高脂饲料喂养C57BL/6J 雄性小鼠建立冠心病痰瘀互结证动物模型，通过模拟心肌缺血复合动脉粥样硬化的病理特征，确定该模型制备成功。周晟芳等[15]根据“恐伤肾”以及“寒凝血瘀”中医理论，对Wistar大鼠采取惊吓同时使其处在寒冷环境的方法，皮下注射激素氢化可的松，再通过结扎大鼠冠状动脉的前降支，复合建立心肌缺血型的冠心病肾虚血瘀的病证结合的模型，通过大鼠体征、生化检验、心电图等来确定造模成功。黄烁等[16]采取让Wistar 雄性大鼠疲劳跑步运动，同时给予其左冠状动脉前降支行高位结扎的方法，观察心电图、大鼠体征、超声心动图、行为习惯、心脏病理检验等指标，表明已建立冠心病气虚血瘀证病证结合模型。目前，对于如何检验临床冠心病一些证型，已经初步有一系列方法及标准，例如，心电图对瘀血阳微证、心肺气虚证和气阴两虚证有诊断意义，心脏X 线对气阴两虚证、心肺气虚证、气滞痰阻证和阳虚气滞证有诊断意义，等等[17]，但是对于建立动物模型尚未有完整研究，且这些临床检验指标大部分不适用于动物模型，因此，仍需要进一步深入研究。

1.3 哮喘的病证结合的动物模型

支气管哮喘（简称哮喘）是临床中较为常见的慢性呼吸道疾病，临床主要表现为反复发作性的胸闷咳嗽、气喘，病情迁延难愈[18]。哮喘在目前临床上治疗方法以吸入性糖皮质激素为主，但治疗效果有限[19]。中医认为，哮喘常见的证型是肺虚、肺肾两虚、肺脾两虚等[20]，治疗上不仅可以改善症状，减轻西药依赖性,还可以减少哮喘的急性发作次数。因此，建立病证结合哮喘模型为促进中西医结合治疗哮喘的发展奠定坚实的研究基础。

厉蓓等[21]使用Balb/c 雄性小鼠，采用卵蛋白反复激发法建立肺气虚哮喘模型，在此基础上，基于“恐伤肾”原理用C57BL/6J 小鼠作为攻击者模拟社交应激，通过哮喘相关理化指标判定成功建立肺肾气虚哮喘动物模型。王志旺等[22]用皮下注射致敏液的方法激发小鼠哮喘，成模后对小鼠灌胃甲状腺片溶解物，检测小鼠肺通气功能以及肺组织哮喘相关蛋白表达等指标，成功建立阴虚哮喘病证结合动物模型。嵇冰等[23]制备模型时采用氢化可的松注射液皮下注射及卵清白蛋白致敏法，通过大鼠行为表现、体征、体液检验、生化检验、肺组织病理等一系列指标验证，证实肾阳虚证支气管哮喘的病证结合动物模型建立成功。关于哮喘病证结合动物模型的研究日渐增多，但是不同研究者对其认识不一，导致病证结合动物模型研究良莠不齐。研究者构建哮喘动物模型时，致敏因素不够确定，不同的致敏因素效果不同，也无法确定是否影响到其他指标，并且研究者对动物的行为观察，如喷嚏、咳嗽等，具有很大程度的主观性，研究者检测的指标也不够统一完善。

1.4 类风湿性关节炎的病证结合动物模型

类风湿关节炎是一种以慢性关节滑膜炎为主的系统性疾病，其致残率极高，已经严重影响到患者的生存质量[24]。类风湿性关节炎在中医上属于“痹症”范畴。目前，临床上的主要治疗药物多以西药为主，虽效果明显，但是毒副作用较大，而中医药治疗疗效持久，因此中西医结合治疗也许是最有效的治疗方法[25]。由于临床证候研究中存在诸多未知因素，需要构建合适的病证结合动物模型来深入研究。

苏杉等[26]对SD 大鼠皮内注射Ⅱ型胶原乳剂并用改装后的智能人工气候箱和冰水刺激施加风寒湿刺激制备风寒湿类风湿关节炎大鼠模型，通过对比大鼠足跖肿胀度、血清检测指标、AI评分等各项指标，判定成功建立风寒湿痹类风湿关节炎病证结合动物模型。赵宏艳等[27]先用羟基脲法和去势法制备大鼠肾虚模型和利血平法制备大鼠脾虚模型，后采用注射Ⅱ型胶原法制备类风湿关节炎模型，成功后检测类风湿关节炎相关指标，确定成功构建肾虚证与脾虚证类风湿关节炎病证结合动物模型。王蓉等[28]对SD 大鼠皮内注射Ⅱ型胶原乳剂制备类风湿关节炎大鼠模型，再把大鼠放入人工气候箱进行风湿热模型构建，通过观察大鼠一般情况及检测相关指标，证实成功建立风湿热痹类风湿性关节炎。目前，类风湿性关节炎动物模型仅模拟了患者的部分特征，其他多系统病变如晨僵、关节压痛等不适很难体现出来，仍有很大局限性。

1.5 其他病证结合动物模型

除了上述几种研究较多、发病率较高的疾病外，研究者还研究了其他疾病相关的病证结合动物模型。例如，陈奔等[29]在树鼩双侧脑室注射混合溶液，并在其腹腔注射角叉菜胶溶液，通过观察树鼩的一般情况，检测痴呆和血瘀相关指标，证实血瘀证病证结合痴呆模型制备成功。杨新鸣等[30]采用细菌内毒素腹腔注射法联合来曲唑灌胃法构建肾虚血瘀型多囊卵巢综合征病证结合大鼠模型，并通过观察大鼠一般行为活动及检测相关血清指标等验证模型建立成功。郭军雄等[31]采用番泻叶灌服法联合慢性束缚应激法建立了腹泻型肠易激综合征“肝郁脾虚证”大鼠模型，通过观察大鼠行为及检测与胃肠道相关的血清等指标证实该模型制备成功。

综上所述，现阶段病证结合模型的构建大多数是在现代疾病造模的基础上，通过符合中医病因理论的外部刺激、饮食、药物等因素刺激，多种因素叠加制作而成。但这些造模方法存在缺乏统一性、可操作性及重复性差等不能回避的问题，有待进一步研究解决。

2 关于病证结合动物模型的评价

病证结合的动物模型的评价，应是研究的重点部分，不仅包括西医“病”的评价，还包含中医“证”的评价。在现代科学研究的动物模型中，西医疾病的判定已较为成熟，在此不做详细赘述，但是现阶段中医证候属性的评价判定，仍然存在一定的不确定性，因此建立病证结合的动物模型，证候属性的判定应是核心环节[32]，目前研究模型评价多从以下几个方面来判定。

2.1 从动物模型的宏观体征及行为表现来判定

买鹏宇等[33]通过多因素复合法建立湿热挟瘀证自身免疫性前列腺炎KM 小鼠模型，依据小鼠精神萎靡懒动、饮食饮水减少、毛发少光泽、舌体暗红和大便溏稀等证候评价，判定湿热挟瘀证模型构建成功。曾梅艳等[34]建立脾胃虚寒型十二指肠溃疡大鼠模型，模型大鼠不仅饮食、饮水量减少，出现倦怠，行动呆滞，大便溏泻等体征，更是出现明显毛发疏松粗糙甚至竖立发黄，大便溏泻、肛门污秽等现象，接近于中医脾胃虚寒型十二指肠溃疡征象。目前，中医证候的判断大多依据临床指南或专家共识，如血瘀证冠心病参考《冠心病及急性心肌梗死中医临床辨证标准及防治指南》规定，血瘀证辨证要点为胸痛，痛有定处，舌质紫黯，或有瘀点、瘀斑[35]。在患者身上，这些证候属性最为直接，但是在动物模型上，临床的四诊信息也很难一一体现。此外，研究者主观推定的诊断信息也存在不确定性，且不易量化，故据此判定动物模型的证候往往证据不足[32]。

2.2 从一些与证候相关的理化指标判定

研究者采用理化指标来判定，通过检测与构建证型相关联的一些指标，侧面证实模型建立成功，如郭文鹤等[36]用血液流变学、凝血功能、升主动脉和肝组织的病理学等指标，来衡量气滞血瘀证动脉粥样硬化病证结合大鼠模型是否构建成功。虽然目前研究者找到了一些与证候相关的理化指标，但是大多数与血瘀型有关，至于气虚、痰浊、阳虚等证型，尚未发现可信度高的相关理化指标。已经确定的一些与证候相关的理化指标，特异性也不够，不能作为确定证候诊断的明确指标，无法证明这些指标的外在表现与患者外在证候是一致的。因此，以此来判定模型的证候属性，同样存在缺陷。

2.3 从中药药物的反证法来判定

中药药物的反证法即以方测证，是通过选择临床上常用且疗效明显的经典方药，来反证造模成功。如郭春荣等[37]通过检测金匮肾气汤对大鼠有治疗效果而六味地黄汤不仅没有效果反而加重哮喘，反证肾阳虚哮喘大鼠模型建立成功；李依洁等[38]建立脾肾阳虚型肠易激综合征的病证结合的动物模型，给予温肾健脾方反证，大鼠行为表现及体征指标改善。研究者通过比较干预前、后一些较为特异性的检测指标，来反推此模型属于哪一种证型。依据方剂反测其证候属性，这种方法极具有中医特色，但是仍存在一些问题：首先，反证法不具有特异性，中药汤剂相对中医的证并没有一对一的关系，药物反证无效也不能证明完全不对证，药物有效也可能是相似证；其次，是反证法所采用的经典方药没有统一参考标准，研究者自圆其说；最后，以方测证过程的谨慎性与严密性也不够。因此，目前大多数的研究只是把该反证法作为佐证。

2.4 从造模的因素推测判定

认定证候属性也可以从病因角度推测。黄正团等[39]基于“恐伤肾”原理用夹尾恐吓法建立肾虚证病证结合模型；于春月等[40]建立气虚血瘀型慢性萎缩性胃炎的病证结合的动物模型，采用N-甲基-N＇-硝基-亚硝基胍、雷尼替丁饲料、水杨酸钠和饥饱失常四个因素综合造模法，可以制备气虚血瘀动物模型。审因测证，即从中医的病因来直接推测其证候的属性，同样存在一定的弊端：一方面缺乏肯定的证候诊断方法，另一方面同样的致病因素有可能出现不一样的中医证候，影响了判定模型证候应具备的唯一性。

大部分研究者对病证结合的动物模型的评价标准仍然主要通过以上四种方法，模型评价方面目前仍存在较多的问题：第一，混合杂乱的造模因素不完全是中医临床上常见的病因；第二，动物模型症状和体征的采集方式和评价不够完善；第三，客观指标和中医的证候没有密切的联系；第四，以方测证存在方法学重要缺陷[41]。本研究认为，病证结合的评价，应当不仅仅从单一的以上四种方法，还要叠加以上要素，力求每一个造的病证结合动物模型，在宏观体征及行为表现、一些与证候相关的理化指标、从造模因素推测判定方面均符合造模评价，并且能够从中药药物方面反证。但具体的评价的度，以及如何判定该要素是否可以或足够作为病证结合动物模型的评价标准，仍然是未来待突破的问题。

3 病证结合动物模型的应用

目前，病证结合动物模型已广泛应用于各种疾病的研究中，能较好体现中医辨证论治的思想，其主要应用于以下五个方面：①用于研究证型与疾病之间的关系，如肺肾气虚证型可以加重哮喘，哮喘的发生也多伴有肺气虚等；②探究不同病因对不同疾病及证型的影响，如研究寒冷气温刺激对动物患寒凝血瘀型冠心病的影响；③还可用于研究疾病的各种治疗方法的疗效评价，如推拿和活血化瘀药均可以缓解血瘀证，但是推拿可能更易于缓解局部血瘀而用药倾向于缓解全身等；④病证结合动物模型能够较好地模拟临床患者的证型，研究者可以择选出最佳方剂干预该疾病和证型；⑤可用于病证毒理学的研究。

病证毒理学研究多采用正常动物来探究药物量-时-毒关系，如有研究者探索不同浓度的加减当归芍药汤对正常小鼠的最大耐受量[42]，病证结合模型可能为中药病证毒理学提供新的方向，探索不同证型下中药及中西医结合用药的安全性，促进精准用药的发展，降低临床上药源性疾病风险[43-44]。

4 思考与展望

目前，如何构建病证结合的动物模型，以及准确对其进行评价的研究还处于探索阶段，问题仍然较多：①现阶段制备模型时采用中医病因造模较少，大多数都采取西医疾病病理概念造模；②研究者在采用单因素造模时，虽然可以较好的确定单个病因对应单个证型，但是模型与现实疾病的复杂性不相符。然而，在采用多种因素造模时，这些因素之间的相互关联性难以证实，变量过多，可重复性差，并且中医西医因素混合，缺乏逻辑性；③现阶段造模的评价方法尚缺乏量化的标准，不能够准确的评价造模是否成功，其中分为两类：一类是证候可通过理化指标来判定，但是判定标准不明确，如血瘀证可通过血液流变学等指标检测，测定指标类型与判定标准尚未完全确定；另一类是暂未找到合适的理化指标，只能通过较为主观的一些评判标准，如肝郁脾虚证大多数只能通过动物行为观察及稀便来判定；④中医病证结合模型的可重复性较差，不如西医病理模型具备定量复制的优点，而且模型质量的稳定性等也有待提高；⑤现代医学中医证候的诊断标准正在不断完善，但是现阶段病证结合所制备的动物模型并不能够与临床病证完全吻合，因此模型只能模拟反映临床疾病的一部分，而反映的这部分也不是百分百定量确定的；⑥在以方测证时，研究者对选用的经典方也口径不一，目前尚未确定如何选择最合适的方药来对模型进行验证，使模型制备更符合临床标准。

值得庆幸的是，致力于科研与临床的研究者对不同病证结合的动物模型的造模方法，仍在不断对比、筛选及优化。更有研究者致力于构建集系统性与严谨性于一体的病证结合的动物模型和评价体系。众多研究者期待随着现代医学对中医药研究的逐步完善与深刻挖掘，在现有研究成果的基础上，病证结合动物模型必然能使中医药体系长足发展，在未来更上一层楼。