固有免疫应答在牙周炎中的作用

刘乙臻 吕广应 综述 王琳源 审校

牙周炎是由牙周菌斑微生物引起的，发生在牙齿周围组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性炎症性疾病，是临床常见的口腔三大疾病之一，不仅是导致牙齿缺失的主要原因，也是其他系统性疾病如糖尿病、心脑血管疾病、关节炎等的诱发因素，严重影响人们的生活质量和全身健康。近年研究表明宿主对抗牙周致病菌的免疫应答(包括固有免疫应答和适应性免疫应答)在牙周炎的发生、发展和转归中发挥着重要作用。固有免疫应答是体内固有免疫细胞(单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞等)和固有免疫分子(补体、急性期蛋白等)非特异性地识别、结合病原体及其产物或其他抗原性异物后被迅速活化，并产生相应的生物学效应，从而将病原体等抗原性物质杀伤、清除的过程，是宿主抵御致病微生物的第一道防线。本文对目前国内外关于固有免疫应答在牙周炎中的作用研究进行综述，说明固有免疫应答在牙周炎发生中的作用和意义。

1 固有免疫细胞在牙周炎中的作用

1.1 单核/巨噬细胞

单核/巨噬细胞是免疫系统的重要成员之一，是免疫系统侦查入侵病原体及异质性抗原的前哨，能够启动固有免疫反应，其抗原呈递作用对适应性免疫的启动也非常重要。根据巨噬细胞在不同细胞因子作用下的极化特点，分为M1型和M2型巨噬细胞，巨噬细胞在Th1细胞产生的白介素-2(interleukin-2，IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ， IFN-γ)的作用下分化为M1型细胞，M1型细胞能产生高水平的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等，专职提呈抗原，参与正向免疫应答，具有促炎性作用；巨噬细胞在Th2细胞产生的白介素-4(interleukin-4，IL-4)和白介素-13(interleukin-13，IL-13)的作用下分化为M2型细胞，M2型细胞能表达高水平的精氨酸酶(arginase-1，Arg-1)、FXⅢ-A及抗炎性细胞因子白介素-10(interleukin-10，IL-10)，仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子下调免疫应答，具有抑炎性作用。

巨噬细胞作为组织常驻细胞，是遇到外来抗原的第一个免疫细胞。随着巨噬细胞在感染部位的聚集，暴露于更多刺激性物质，如宿主衍生的细胞因子、趋化因子以及病原体配体,分化为不同表型的巨噬细胞，M1巨噬细胞和M2巨噬细胞，通过与病原微生物的相互作用，分泌促炎性细胞因子和趋化因子，不仅参与微生物的吞噬还促进炎症的产生，有实验证明，M1巨噬细胞是牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染小鼠的主要局部组织浸润细胞[1]，牙周炎患者病变牙龈组织中主要浸润细胞是M1巨噬细胞，同时也发现少量M2巨噬细胞，释放抗炎因子IL-10,但其水平明显低于促炎因子。诱导性一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase， iNOS)是经典的M1巨噬细胞促炎因子，动物实验发现iNOS敲除大鼠的骨密度和骨体积明显增高，与P.gingivalis感染的正常大鼠相比，P.gingivalis感染的iNOS敲除大鼠破骨细胞数量明显减少，破骨细胞分化减弱，促炎性细胞因子IL-1对骨吸收的促进作用也明显减弱，表明牙周炎时，在P.gingivalis刺激下M1型巨噬细胞可通过分泌iNOS促进破骨细胞分化，加重牙槽骨吸收[2]，此外，也可分泌细胞因子，诱导适应性免疫应答对抗病原菌感染，牙周病原体可以激活单核细胞，单核细胞提呈抗原给CD4+T细胞，导致人类的CD4+T细胞分泌的白介素-17(interleukin-17, IL-17)增加[3]， IL-17可通过激活NF-kB信号通路上调某些基质金属蛋白酶的表达[4]，进而加重牙周炎患者的病变程度。而在炎症缓解期，则主要是M2巨噬细胞发挥作用，分泌抗炎性细胞因子，促进组织修复。

1.2 树突细胞

树突状细胞(dendritic cells，DCs) 是专门的抗原提呈细胞，在补充和激活固有免疫细胞，传递协同刺激信号给初始T细胞，触发适应性免疫反应中发挥重要作用，其分泌的细胞因子能极大地影响固有免疫和适应性免疫反应的质量。单核细胞来源的树突细胞(monocyte derived dendritic cells，MDDCs) 的成熟会伴随着CD1a减少和细胞表面MHC-Ⅱ及协同刺激因子CD80、CD86表达的增加，促进抗原提呈，活化CD4+T和CD8+T细胞，从而促进机体的免疫反应。而浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cells，PDC)表达低水平的MHC-Ⅱ和协同刺激因子，高水平的CD123，不能刺激抗原特异性T细胞增殖，进而减弱机体的免疫应答。DCs处于非成熟状态时具有吞噬细菌能力，能抵抗微生物入侵，但同时牙周抗原也可通过促炎性细胞因子间接调节DCs细胞的功能。暴露于P.gingivalis后，牙龈组织细胞如成纤维细胞、角质细胞会分泌促炎性细胞因子，DCs细胞在这些促炎性细胞因子刺激下，诱导Th2和Treg细胞的增殖，而Th2细胞可促进M2型巨噬细胞分化，分泌抗炎性细胞因子，Treg细胞也可分泌抗炎性细胞因子，减轻炎症反应；当DCs细胞与细菌直接作用时，DCs细胞会诱导Th1细胞扩增，Th1细胞可促进M1型巨噬细胞分化，分泌促炎性细胞因子，加重炎症反应[5]，此外P.gingivalis来源LPS会识别TLR2，并诱导DCs成熟，这说明P.gingivalisLPS可诱导人DCs细胞产生基质金属蛋白酶-9，提示当DCs遇到P.gingivalisLPS后会加速组织损伤和牙龈中白细胞浸润[6],加重炎症反应。DCs的初始成熟与趋化因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)密切相关。牙周感染后，CCR7可调节DCs细胞迁移到淋巴节点(lymph node，LN)，然后DCs捕获、加工、处理抗原，通过MHC-Ⅰ向CD8+T细胞提呈抗原，通过MHC-Ⅱ向CD4+T细胞提呈抗原，诱导淋巴细胞的增殖，激活未致敏的初始 T 细胞和抗原特异性B细胞分化成浆细胞，调节适应性免疫反应，与牙周炎的发生、发展密切相关[7]。

1.3 中性粒细胞

中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)又称中性粒细胞(neutrophil)，是最早对菌斑生物膜做出反应的免疫细胞。PMN的数目异常和功能缺陷都会增加牙周炎的易感性和严重程度。PMN表面不仅具有细胞趋化反应受体，还有与细胞吞噬有关的受体─Fc受体。中性粒细胞是移动最快的哺乳动物细胞，牙龈组织中的PMN沿着由结合上皮中IL-8和细胞间黏附分子1(ICAM-1)形成的趋化梯度穿过结合上皮移至感染部位，在补体和抗体的协同作用下吞噬细菌，通过氧化或非氧化机制杀灭胞内的细菌，随后PMN由巨噬细胞摄取清除。最新研究发现，牙周炎患者外周血白细胞趋化作用有缺陷，会增加其在组织中的移动时间，从而造成相应组织损伤[8]。PMN募集和趋化功能的障碍会导致抗炎信号缺乏，促炎性IL-17、G-CSF表达增高，外周血中PMN数量不断增高，同时持续表达的IL-17会促进牙周膜细胞表达核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)，抑制骨保护素(osteoprotegerin，OPG)表达，加重骨吸收。此外，在与菌斑微生物相互作用的过程中，激活的PMN不仅吞噬和杀灭胞内细菌，还合成释放酶、前列腺素等生物活性物质破坏牙周组织结构，如弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的增多，会引起组织胶原纤维的解聚，增加局部组织的渗透性，从而增加了牙周炎的易感性，导致牙周组织损伤。研究发现局限型侵袭性牙周炎与PMN的过度激活有关，PMN相关的促炎性细胞因子高表达，而吞噬功能发生障碍，会使应激反应过度，病原体清除不力，加重牙周局部的炎症程度[9]。此外，PMN还可以通过呼吸爆发机制产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，过量的ROS会对组织细胞造成损伤[10]。总的来说，在牙周炎的病变组织中，一方面牙周致病菌的细胞成分和炎性因子引起高敏性PMN的激活、聚集，从而加速ROS的产生，另一方面组织损伤可通过产生脂质过氧化物、炎症介质及氧化蛋白质激活PMN，进而加重局部炎症程度和组织损伤。

1.4 肥大细胞

肥大细胞(mast cells)是炎症介质的有效来源，激活后的肥大细胞能产生组胺、白三烯、前列腺素、蛋白酶和一些细胞因子及趋化因子，能吸引PMN 到达炎症感染区域，清除细菌，同时肥大细胞还可以吞噬并加工细菌抗原以提呈抗原给T细胞，进而参与适应性免疫反应。研究发现健康牙龈组织中仅有少量肥大细胞，而在牙周炎的病变牙龈组织中肥大细胞以及脱颗粒肥大细胞明显增多，且与牙周炎的炎症程度和组织损伤密切相关，表明肥大细胞参与牙周炎的发病过程[11]。Malcolm等[12]研究发现，P.gingivalis感染肥大细胞缺乏小鼠和正常小鼠后，P.gingivalis感染的正常小鼠牙槽骨吸收明显，而肥大细胞缺乏小鼠则未出现明显牙槽骨吸收，表明肥大细胞参与牙槽骨的吸收过程。与正常小鼠相比，肥大细胞缺乏小鼠的TNF和IL-6表达降低，提示肥大细胞可能通过产生TNF 和IL-6参与牙周炎的发病过程。Sushma等[13]人实验发现，在牙周炎症感染组织中肥大细胞数量要多于健康牙龈组织，这说明肥大细胞的数量和牙周炎有关。组胺可破坏组织屏障，造成水肿并促进细胞浸润，而组胺是肥大细胞分泌最丰富的产物，有动物实验研究发现抑制大鼠对组胺的摄取能抑制破骨细胞的产生和激活[14]，也表明肥大细胞可通过组胺促进牙槽骨的吸收，从而加重牙周炎症程度。

2 固有免疫分子在牙周炎中的作用

2.1 补体

补体是血清和体液中一组具有酶活性的蛋白质，能调节免疫和炎症信号通路，调节宿主体内稳态，是固有免疫与适应性免疫之间联系的一个重要纽带。发生细菌感染时，宿主体内的补体活化，通过补体自身的抗菌作用及免疫细胞的活化，清除微生物，加强免疫，达到控制炎症的作用。一旦补体系统失调则会打破宿主的菌群平衡，导致炎症反应的发生和组织破坏。补体有三种抗菌作用：直接杀菌作用，调理素作用和吞噬作用。有些补体如C5b-9膜攻击复合物能够直接溶解细菌细胞膜，导致细菌死亡，,即直接杀菌作用。调理素作用即补体片段在病原体的目标表面沉积，通过与吞噬细胞表面的特定受体结合，如通过C3a和C5a激活G蛋白偶联受体C3aR和C5aR，刺激中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞的识别、摄入和破坏作用。IgG抗体和C3片段都是经典调理素，C3片段中的CR3和CR4是iCR3的特异性受体，细菌经过补体iC3b调理后，即能被白细胞表面受体CR3识别，细菌与吞噬细胞发生黏附并陷入吞噬细胞，从而吞噬细菌。此外，补体可以刺激白细胞分泌TNF和GM-CSF，调节辅助性T细胞和巨噬细胞，提高细胞免疫和T细胞依赖的抗体分泌，增强机体免疫力。在牙周炎发病过程中，补体作为固有免疫分子，一方面通过调动机体防御反应，保护宿主，另一方面还可以直接作用于免疫细胞或通过调控信号传导通路，协助病原菌进一步感染和破坏牙周组织，协同Toll样受体放大固有免疫和炎症反应，导致组织损伤[15]。

在炎症条件下，GCF在血清中含有高达70%至80%浓度的补体。且从牙周炎患者收集的GCF含有比来自健康个体的GCF更高浓度的活化补体片段[16]，通过C3转化测定，发现诱导实验性牙龈炎的人类志愿者的活化补体会随着临床炎症参数的升高而进行性升高[17]，相反，正在接受治疗的牙周炎患者炎症的缓解导致补体活性降低，如GCF中C3-C3c转化率的降低。这些结果都说明牙周炎时系统失衡，补体过度活化，促进炎症反应的发生和组织破坏，因此如果能抑制补体的过度活化，可以缓解牙周炎症的发展。

2.2 急性期蛋白

发生炎症时，急性期蛋白(acute phase proteins，APP)血浆浓度会出现增加或减少,这种反应称为急性期反应。C-反应蛋白(c-reactive protein，CRP)是最强的APP之一。急性组织损伤后，在24～48 h内血清或血浆中CRP水平增高，在急性期达到高峰，随炎症或创伤的减弱而降低，因此，CRP水平的高低可为炎症及相关疾病过程的诊断、监控及治疗提供信息。研究发现牙周炎患者血清中CRP质量分数明显高于健康对照组，且血浆和龈沟液中CRP水平与牙周炎的炎症程度密切相关[18]，而目前尚不知道牙龈组织是否能产生CRP，但牙周治疗后牙周炎患者血浆和GCF中CRP水平下降，表明CRP参与牙周炎的发病过程[19]。乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种特别表达分布的急性期蛋白，仅在PMN次级颗粒中大量存在，在其他白细胞中不存在，在血浆中微量存在。有研究报道，与健康者相比，牙龈炎和牙周炎患者龈沟液中LF含量增高，且其含量与炎症临床指标相关[20]，提示GCF中LF可作为评估牙周治疗效果的一个有效指标。

2.3 Toll-like受体

Toll 样受体 (toll like receptors，TLRs) 是固有免疫系统中的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRR)，是固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，能识别微生物表面的高度保守结构并通过细胞间信号通路活化固有免疫细胞，激发固有免疫应答。到目前为止，人类中发现有十种TLR，能识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。根据PAMPs类型可将TLRs分两类，一类主要识别由脂质和蛋白质组成的PAMPs，另一类主要识别由核苷酸组成的PAMPs。有研究发现，与健康牙周组织相比，慢性牙周炎患者的牙周组织中TLR2和TLR4表达明显增高，表明TLR2和TLR4参与牙周炎的发病过程[21]。TLR2缺失小鼠感染后牙周炎症更严重，有更明显的牙槽骨丧失，但是IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子也明显减少[22]，说明TLR2既参与抗炎因子产生也参与促炎因子产生，具有抗炎和促炎的双重作用。Sahingu[23]发现牙周炎患者的TLR9基因表达明显上调，提示牙周炎中牙槽骨吸收可能由TLR9调控。

2.4 防御素

防御素包括α-防御素和β-防御素，不仅能增强固有免疫系统，还能通过促进单核细胞、T淋巴细胞、树突细胞及肥大细胞向炎症感染位点的趋化作用来增强适应性免疫系统。α-防御素主要存在于结合上皮中，由多形核白细胞表达。研究发现牙周袋中细菌侵入组织和高水平的蛋白酶激活会引起α2巨球蛋白激活水平升高，而宿主-抗原通过硫酸皮肤素和α2巨球蛋白相互作用可导致直接灭活或清除防御素。因此，在牙周炎中α2巨球蛋白水平升高会降低防御素水平[24]。β-防御素包括hBD1、hBD2 和hBD3，主要存在于龈沟上皮，由黏膜上皮细胞表达，hBDs可通过与趋化因子受体6(chemokine receptor 6，CCR6)的相互作用刺激抗原提呈细胞树突细胞和记忆性T细胞向细菌入侵位点趋化，促进机体的免疫反应。Liu等[25]研究发现与健康牙龈组织相比，慢性牙周炎患者的病变牙龈组织中hBD3蛋白表达水平降低，而hBD3 mRNA表达水平增高，推测牙龈组织中hBD3蛋白表达减少是因为牙周炎时局部组织对hBD3的消耗，hBD3在牙周炎的发病过程中可能发挥保护性作用。

3 展 望

综上所述，宿主的固有免疫应答是一把双刃剑，在发挥着对牙周组织防御保护作用的同时，也可造成牙周组织损伤。牙周炎的发生发展是宿主的免疫保护和免疫破坏机制不平衡所致。理解宿主固有免疫应答在牙周炎发生过程中的重要作用及可能的机制，有助于阐明牙周炎的发生机制，为牙周炎的防治提供理论基础和防治原则，并为牙周炎新疗法的开发奠定基础。