创伤性脊髓损伤后Notch 信号对相关神经细胞的调控作用

张勇，谭龙旺，朱伟，杨艺，乔旭

(1.陕西中医药大学，陕西 西安；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 西安)

0 引言

创伤性脊髓损伤(traumatic spinal cord injury，TSCI)是指脊髓组织受到外来暴力后出现的一系列以脊髓实质被破坏、功能被抑制的一种中枢神经系统性疾病，其主要表现为受损节段平面以下肢体感觉、运动及反射出现障碍[1]。TSCI 的不可逆性以及其极高的致残率，长期以来给家庭、社会乃至国家造成了沉重的负担。TSCI 发生后，小胶质细胞可活化为M1、M2 两种不同的细胞类型，其分别起着促炎、氧化和抗炎、修复的作用[2]。M1 型小胶质细胞分泌的炎症因子、氧化产物可再次引起周围健康神经组织的坏死，炎症因子最终引起星形胶质细胞向A1 型活化，产生胶质瘢痕。胶质瘢痕因其组织的致密性可阻止各种理化因子的扩散，保护未受损的神经细胞，但恰恰也是这些致密的纤维组织阻碍了脊髓神经元的重新连接，这使得后期使用神经干细胞移植来修复脊髓往往很难达到理想的效果。随着医学研究的深入，TSCI 发生后相关信号通路的调控机制开始越来越被人们重视。通过文献索引发现[2-7]，TSCI 发生后抑制Notch 信号通路可引起小胶质细胞偏向M2 型活化，并间接减少了A1 反应性星形胶质细胞的产生、同时也可诱导神经干细胞分化为神经元和少突胶质细胞，这为TSCI 的治疗提供了新的思路。

1 Notch 信号通路概述

1.1 组成

Notch 信号通路在哺乳动物中由4 种受体(Notch1-4)和5 种配体(DLL1-4，Serrate 样配体Jagged1-2)以及转录调节因子(RBP-Jκ)和下游靶基因组成[5,6,8,9]。

Notch 受体中Notch1 受体在细胞内结构域包含36 个EGF 重复，而Notch2 包含35 个，Notch3 包含34 个，Notch4包含29 个。Notch 受体是由两条非共价相关的多肽链形成的单程跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜域和胞内域3 个部分[8]。

Notch 配体是一种保守的I型跨膜蛋白，因为在果蝇和线 虫 中 叫 做Delta、Serrate 和Lag-2，Notch 配 体 也 被 称 为DSL(Delta/Serrate/Lag-2)蛋白[5,9]。

转录调节因子是一组DNA 结合蛋白，在哺乳动物、果蝇和线虫中分别被叫做：CBF-1、Su(H)、Lag-1，被称为CSL{CBF-1/Su(H)/Lag-1}蛋白[6]。

下游靶基因主要由bHLH 转录因子基因家族成员组成，分为抑制型基因和原神经基因两类，其中原神经基因包括神经分化发育相关基因Mash-1、Math、Ngn1、2、NeuroD、Olig基因(Olig1、Olig2 和Olig3)[10-14]；抑制型以HES-1、HES-3 和HES-5 及HES 相关蛋白基因(HERP)[15]，以及具有促炎效应的NF-κB(nuclear transcription factor)[16]。有研究证实抑制型bHLH 基因表达抑制原神经基因[17]。

1.2 作用机制

Notch 信号通路的激活方式有两种，分别为CSL 依赖信号途径和CSL 非依赖信号途径。

CSL 依赖信号途径是经典的Notch 信号途径，在Notch 受体与配体相结合后，肿瘤坏死因子-α 转换酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE) 被 激 活，将 受 体 切 割为2 个片段，N 端裂解产物在胞外区被配体表达细胞内吞，而C 端裂解产物( 跨膜区) 在γ- 分泌酶剪切下，释放出具有核定位信号NICD(Notch 蛋白的活化形式)，随后NICD 转移至核内，与转录抑制因子RBP-Jκ 结合成为(NICD/RBPJκ) 复合体，招募核转录激活蛋白家族MAML(mastermindlike) 组成(NICD/RBP-Jκ/MAML) 共激活复合体，调节下游靶基因(HES-1、HES-3 和HES-5 等)，通过靶基因的表达来调控细胞的功能[18,19]。在没有NICD 的情况下(Notch 受体与配体未结合)，RBP-Jκ 则招募阻遏复合物蛋白(SHARP)形成(RBP-Jκ/SHARP) 抑制复合物抑制Notch 下游基因的转录[20]。

CSL 非依赖信号途径直接通过下游基因Deltex 调控Notch 信号的表达。其方式为Notch 受体胞内区上的ANK 重复结构与锌指蛋白Deltex 结合，信号激活后直接与Grb2 作用，介导Ras-JNK 信号途径[21]。

2 小胶质细胞的活化

小胶质细胞起源于骨髓造血干细胞，后分化为单核巨噬细胞，通过血液循环广泛存在于大脑、脊髓等神经系统中，也有人认为早在在胚胎期和胎儿期小胶质祖细胞就通过血管外途径定植于神经系统。作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，小胶质细胞可以通过吞噬微生物来保护大脑免受感染，也正是它们在生理条件下识别、吞噬和消化凋亡神经元的能力，使其在神经系统的形成和完整性中发挥至关重要作用[22,23]。研究表明[16,24]Notch 信号通路相关蛋白同样可在小胶质细胞中表达，在TSCI 发生后，缺氧条件激活了Notch 信号通路，其下游中具有促炎效应的NF-κB 基因(抑制型bHLH 基因)在小胶质细胞内发生了表达，小胶质细胞向M1 型活化，M2 型小胶质细胞的活化则可能由其他通路诱导。活化后的M1 型小胶质细胞可以产生一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)，NO 可与ROS 反应产生多种活性氮类攻击细胞膜上不饱和脂肪酸引起脂质的过氧化，这反应产生了两种影响：一方面，细胞膜脂质过氧化造成 DNA 分解和线粒体呼吸功能障碍，最终引起局部细胞的衰退[25,26]。另一方面，细胞膜Na+-K+泵被破坏，破坏细胞渗透平衡，引起细胞内电解质紊乱，Ca+内流，最终引起细胞坏死和凋亡[27-29]。此外，NO 还参与了脱髓鞘改变[30]。M1 型小胶质细胞同时还参与了炎症反应，它们分泌IL-12、IL-6、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(TNF-γ)等大量促炎细胞因子对神经、血管产生毒性作用，进一步加重脊髓的损伤。M2 型小胶质细胞则具有抗炎和修复的作用，其主要通过诱导清除剂受体和基质降解酶来减少氧化反应和炎症的发生，并且清除剂受体和基质降解酶也可增强其吞噬能力。与M1 型小胶质细胞相比M2 更具有血管生成潜力，M2 型小胶质细胞可产生血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)和成纤维细胞生长因子(fgf)来促进血管生成。在脊髓损伤后7d，以M2 型小胶质细胞活化占主导，反应达到峰值，28d 后M1 型小胶质细胞活化为主导达到第二个峰值[28,31]。这说明了TSCI 中M1 型小胶质细胞在损伤后期占主导地位，M2 型在损伤前期占主导作用[2,32,33]。

种莉[24]等发现在静息条件下小胶质细胞不具有释放炎性介质及氧自由基等毒害因子的作用，而通过缺氧诱导后的小胶质细胞会迅速发生活化，大量分泌分泌IL-6、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等产物，且活化后的小胶质细胞内Notch1 胞内段N1ICD、Hes1、Hey1 表达明显升高，更有趣的是在实验中通过DAPT(γ-分泌酶抑制剂)阻断NICD，抑制Notch 通路后，小胶质细胞内N1ICD、Hes1、Hey1 表达降低的同时细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α 的分泌水平也降低。在同样的方式下Wu[34]等用DAPT(γ-分泌酶抑制剂)阻断Notch 途径时，发现M1 型小胶质细胞标志物的表达水平降低，M2 型小胶质细胞标记物的表达水平升高。这表明通过阻断NICD 的方式来抑制Notch 信号通路，可使得小胶质细胞的活化更偏向于M2 型。

3 Notch 信号通路对星形胶质细胞的作用

星形胶质细胞是脑、脊髓等中枢神经系统结构的重要组成部分，在传统上被认为是稳定和营养神经系统的细胞，它们具有摄取和释放兴奋性神经递质谷氨酸的能力，参与了突触的传递。作为神经系统的结构和营养支持，星形胶质细胞能够调节脑血流并释放S100B 和脑源性神经营养因子(BDNF)以达到营养神经元的目的[34-36]。此外，还有研究发现星形胶质细胞还具有刺激神经元突触的生成的能力，并在神经发育过程中促进突触的密度，更有意思的是星形胶质细胞靠吞噬作用来修剪突触[37,38]。

在TSCI 发生后星形胶质细胞会产生A1 型和A2 型两种活化，其中A1 反应性星形胶质细胞由M1 型小胶质细胞所分泌得炎症因子引起[38]。A2 反应性星形胶质细胞由缺血环境诱导生成，它能够上调了许多神经营养因子，可促进中枢神经系统功能的恢复。星形胶质细胞A1 型活化后失去了营养神经元、促进突触生长、吞噬突触和髓鞘碎片的能力，相反它会产生一种有毒物质，迅速杀死神经元和成熟的少突胶质细胞，在急性中枢神经损伤中，轴突断裂后导致视网膜神经节细胞死亡的不是并因为营养缺乏，而是A1 反应性星形胶质细胞毒素的释放，但这种可溶性毒素唯独对神经元和少突胶质细胞具有毒害性，对其他类型的中枢神经系统细胞却没有作用[38]。通过抗炎性细胞因子TGFβ 处理后，A1 反应性星形胶质细胞转录水平显著降低，但对于体内是否还有别的信号介导生成A1 反应性星形胶质细胞，目前还不得而知[38]。但明确的是降低M1 型小胶质细胞的水平或者抑制炎性反应可减少A1 反应性星形胶质细胞的转录[39]，从前文中可知抑制Notch 信号通路可以制止小胶质细胞向M1 型活化，也意味着抑制Notch信号通路可间接性抑制星形胶质细胞向A1 型的活化。损伤后的胶质反应导致小胶质细胞、少突胶质细胞前体和星形胶质细胞向损伤部位聚集，许多受损区域的星形细胞往往会变得肥大，并释放抑制性细胞外基质分子硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGS)，共同形成了胶质瘢痕，抑制了神经元突触的生长，且CSPGS 本身具有抑制损伤后神经再生的能力[40,41]。孙嘉锴[39]等发现脊髓损伤后运用弱激光治疗(low level laser therapy，LLLT)可下调M1 型小胶质细胞活化，减轻炎症反应，同时也抑制了星形胶质细胞活化，降低硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitinsulfate proteoglycans，CSPGS)的表达，且胶质瘢痕组织明显减少，证明胶质瘢痕和炎症反应具有相关性。也侧面证明了通过抑制Notch 信号通路来下调M1 型小胶质细胞活化同样可以抑制胶质瘢痕的产生。高枫[42]等发现姜黄素可下调Notch 信号通路中Notch1 和Hes1 表达水平，抑制了脊髓星形胶质细胞的凋亡，与此同时炎症因子IL-6 和TNF-α含量也发生了减少。

综上脊髓损伤的早期通过抑制Notch 信号通路，可抑制炎性反应、减少星形胶质细胞的死亡，同时可以抑制A1 反应性星形胶质细胞的产生，减少毒素的生成和胶质瘢痕的产生。

4 Notch 信号通路对NSCs 的增殖与分化

TSCI 发生后内源性神经干细胞(NSCs)会发生增殖分化为不同的亚型，如神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，它们共同参与神经系统损伤后的修复，但在哺乳动物体内这种分化方式必须经分子水平调控才能实现[43]，而Notch 信号通路同样参与了这一过程[44]。Notch 信号通路下游靶基因多为bHLH 转录因子基因家族成员，分为抑制型基因和原神经基因两种，抑制型基因包括：HES-1、HES-3 和 HES-5 及 HES相关蛋白基因，抑制型基因表达时NSCs 会发生增殖同时具有向星形胶质细胞分化的能力[45-47]；原神经基因包括：Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D、Olig1、Olig2[5,6,9,48,49]，其中Mash-1、Math、Ngn1、2、Neuro D 的表达引起NSCs 向神经元分化，Olig1、Olig2 的表达可以促进NSCs 向少突胶质细胞分化，且抑制型基因表达时可对原神经基因产生抑制作用[5-7,17]。在上文中我们知道抑制型基因的表达由NICD/RBP-Jκ/MAML共激活复合体来调节，因此当DAPT 作用于NSCs 后，NICD的产生受到限制，Notch 信号通路被抑制，抑制基因表达受限，原神经基因转录表达，NSCs 会分化为神经元和少突胶质细胞同时抑制了NSCs 的增殖和分化为星形胶质细胞的能力[50-54]。

Notch 信号通路并不是一直可以影响到NSCs 的增殖分化，在正常脊髓内环境中有一种额外的机制使Notch 信号保持静止，如：对正常斑马鱼脊髓中阻断NICD 来源5d 后，未见髓内神经元数量发生变化。这可能与Notch 信号通路本身特性有关，在没有损伤或临近细胞凋亡的情况下，Notch 就不会引起细胞的分化与增殖，这可能是Notch 信号通路的第三项选择[55,56]。

5 小结

通过上文我们发现：抑制Notch 信号通路可降低M1 型小胶质细胞的活化水平，相反可以促进M2 型小胶质细胞的生成；M1 型小胶质细胞生成障碍可阻止星形胶质细胞的A1 型活化和胶质瘢痕的生成；Notch 信号通路受到抑制，NSCs 将会向神经元即少突胶质细胞分化；激活Notch 信号通路时，NSCs 增殖同时向星形胶质细胞分化。

因此在脊髓损伤的急性期可通过抑制Notch 信号通路来减轻炎症反应以保护血管、神经，抑制胶质瘢痕生成，为神经元轴突的连接创造条件。对于横断性的脊髓损伤可在受损区域移植NSCs 并通过抑制Notch 信号通路的方式诱导NSCs分化为神经元及少突胶质细胞，促进神经发生。

慢性期：主要是激活Notch 信号通路为内源性NSCs 的增殖，星形胶质细胞的生成提供条件。

目前不足的是，脊髓损伤后对脊髓水肿的消除还缺少Notch 通路的研究，脊髓损伤后除了小胶质细胞，还有中性粒细胞、淋巴细胞参与机体炎性反应[57]，对Notch 信号通路限制炎症反应的研究只是局限于小胶质细胞领域，更多关于Notch信号通路对脊髓损伤的作用及机制还待进一步研究。