16种杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用比较

宋化稳，徐娜娜，高德良，胡尊纪，庄治国，刘 钰，吴希宝，庄占兴

（山东省农药科学研究院，山东省化学农药重点实验室，济南 250033）

桃褐腐病又名菌核病、果腐病、实腐病，是由链核盘菌（Monilinia spp.）引起的一种重要病害，世界产桃区均可发生[1]。花期危害造成花腐、僵果和枝条溃疡，果实成熟期危害导致采摘前后和储存期烂果[2]，严重威胁桃产业的健康发展。造成桃褐腐病的病原菌有3种，分别为M. fructicola、M. fructigena和M.laxa。无性态为丛梗孢属真菌Monilia spp.，我国大部分地区以M. fructicola为主要病原菌[1]。链核盘菌（Monilinia spp.）不仅危害桃，还危害苹果、梨、李、梅、樱桃、山楂等仁果和核果果树，同时对蔷薇科作物也可造成危害[3]。

化学防治仍然是防治桃褐腐病的主要方法。作为世界第一产桃大国[4]，目前我国登记在桃褐腐病上的农药仅有腈苯唑和小檗碱盐酸盐2个品种。因此，筛选对桃褐腐病菌高效低毒的杀菌剂品种，在生产中进行混配和轮换用药，对桃褐腐病的科学防控具有重要意义。

前人已多次测定过杀菌剂对桃褐腐病菌的室内毒力[5-18]，但所涉及的杀菌剂品种都不够系统全面，测定方法除房雅丽等[6]采用菌丝生长速率法和孢子萌发法外，其余均采用菌丝生长速率法，未见用孢子萌发法进行系统测定的报道，更没有对2种方法测定数据进行比较的研究，缺乏对各类杀菌剂作用特点的全面系统评价。本研究分别采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了8类16种杀菌剂对山东省肥城地区桃褐腐病菌的室内毒力，以期为桃褐腐病的化学防治进一步提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：桃褐腐病菌，于2019年8月1日采自山东省肥城地区桃园镇北台村桃园。该地种植肥城桃历史悠久，桃褐腐病历年发生严重，桃园使用苯并咪唑类和保护性杀菌剂频率较高。将桃褐腐病病果带回实验室进行单孢分离，用PDA培养基纯化培养，形态学鉴定为美澳型核果链核盘菌（Monilinia fructicola）。

供试药剂概况见表1。

表1 供试药剂概况

1.2 方法

1.2.1 含药PDA培养基制备

根据预备试验结果，用无菌水将16种试验药剂分别稀释成5～8个梯度浓度，分别取3 mL稀释液加入装有约25 mL，50℃左右的灭菌PDA培养基的三角瓶中，定容至30 mL，摇匀后倒入直径9 cm的培养皿内，凝固后即制成含药平板培养基。空白对照为无菌水。

1.2.2 含药WA培养基制备

根据预备试验结果，将16种试验药剂分别稀释成5～8个梯度浓度，分别取3 mL稀释液加入装有约25 mL灭菌WA培养基的三角瓶中，定容至30 mL，摇匀后倒入直径9 cm的培养皿内，凝固后即制成含药平板培养基。空白对照为无菌水。

1.2.3 菌丝生长速率法

在无菌条件下，用直径5 mm打孔器在分离培养5 d的桃褐腐病菌的菌落边缘挑取菌饼，将菌饼置于含药平板培养基中央，每处理重复4次，以不加药剂的PDA平板作为空白对照。置于25℃，12 h光暗交替条件下培养5 d，用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理菌落增长直径及菌丝生长抑菌率。菌丝生长抑制率按式（1）计算。

1.2.4 孢子萌发法

将桃褐腐病菌在PDA平板上，于25℃，12 h光暗交替条件下培养7 d，用无菌去离子水洗分生孢子，用灭菌纱布过滤，充分震荡摇匀制得孢子悬浮液。然后用血球计数板计数观察，将孢子悬浮液浓度调至105～106孢子/mL。

量取100 μL孢子悬浮液均匀涂布于含药WA培养基平板上，于25℃，10 h光暗交替条件下培养20 h。然后镜检观察孢子萌发情况，调换显微镜视野，每重复检查孢子总数不少于200个，记录检查孢子总数及孢子萌发数，以芽管长度达到孢子短直径的1/2视为萌发。每处理重复4次，以不含药剂处理为空白对照。孢子萌发率和萌发抑制率分别按式（2）、（3）计算。

1.2.5 数据处理

数据采用DPS软件进行统计分析。以设定的质量浓度的对数为横坐标（x），抑制率的机率值为纵坐标（y），求出各药剂对供试菌株的毒力回归方程y=a+bx及有效抑制中浓度（EC50值）。

为了更直观地比较各个药剂的EC50值，将每种方法测定的16种药剂中最大EC50值的药剂的相对毒力倍数设定为1.00，计算出各个药剂的相对毒力倍数。相对毒力倍数按式（4）计算。

2 结果与分析

2.1 16种杀菌剂对菌丝生长的抑制作用

16种杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长的抑制作用测定结果见表2。

表2 16 种杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长的抑制作用测定结果

由表2可见，16种杀菌剂抑制菌丝生长的EC50值介于0.018 4～61.530 5 mg/L，其中咪鲜胺、四霉素、腈苯唑和咯菌腈4种杀菌剂对菌丝生长的抑制活性较强，其EC50值分别为0.018 4、0.045 6、0.053 1和0.081 4 mg/L，均显著小于0.1 mg/L，而代森锰锌、百菌清、嘧菌酯和吡唑醚菌酯4种杀菌剂对菌丝生长的抑制活性较低，其EC50值分别为61.530 5、29.732 1、25.532 6和17.501 0 mg/L，均显著大于10 mg/L。

2.2 16种杀菌剂对孢子萌发的抑制作用

16种杀菌剂对桃褐腐病菌孢子萌发的抑制作用测定结果见表3。由表3可见，16种杀菌剂抑制孢子萌发的EC50值介于0.008 4～189.393 8 mg/L，其中四霉素和百菌清2种杀菌剂对孢子萌发的抑制活性较强，其EC50值分别为0.008 4和0.037 8 mg/L，均显著小于0.1 mg/L，而戊唑醇、苯醚甲环唑、腈苯唑、咪鲜胺、多菌灵、异菌脲和腐霉利等7种杀菌剂对孢子萌发的抑制活性较低，其EC50值分别为189.393 8、143.422 1、96.639 3、90.332 0、77.296 7、44.750 8 和31.774 3 mg/L，均显著大于10 mg/L。

表3 16 种杀菌剂对桃褐腐病菌孢子萌发的抑制作用测定结果

2.3 8类杀菌剂的抑制作用特点比较

8类杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用比较见表4。结果表明，苯并咪唑类、麦角甾醇抑制剂和二甲酰亚胺类对菌丝生长的抑制活性较强，但对孢子萌发的抑制活性较弱；保护性杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类和琥珀酸脱氢酶抑制剂对孢子萌发的抑制活性较强，但对菌丝生长的抑制活性较弱；农用抗生素类（四霉素和申嗪霉素）以及吡咯类（咯菌腈）对菌丝生长和孢子萌发均具有较好的抑制活性。

表4 8 类杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用比较

3 结论与讨论

从杀菌剂的作用机制分析，苯并咪唑类（MBCs）主要是抑制细胞的有丝分裂；麦角甾醇抑制剂（SBIs）主要是抑制生物膜的合成；二甲酰亚胺类（DCFs）为信号传导抑制剂，使细胞内渗透压加大而最终死亡。此3类杀菌剂对桃褐腐病菌菌丝生长的抑制活性较强，但对孢子萌发的抑制活性较弱，表明桃褐腐病菌在菌丝生长阶段的有丝分裂、生物膜合成及信号传导活动比孢子萌发阶段更加活跃，受到抑制后效果也更加明显。甲氧基丙烯酸酯类（QoIs）和琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）均为呼吸抑制剂，保护性杀菌剂则作用于多个位点，此3类杀菌剂对桃褐腐病菌孢子萌发的抑制活性较强，但对菌丝生长的抑制活性较弱，表明桃褐腐病菌在孢子萌发阶段的呼吸作用比菌丝生长阶段更活跃，对保护性杀菌剂的敏感性更高，耐受力更差，受到抑制后效果也更加明显。农用抗生素类的四霉素（又称梧宁霉素）和申嗪霉素为多位点杀菌剂，其对桃褐腐病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性均明显高于保护性杀菌剂代森锰锌和百菌清，说明桃褐腐病菌对此2种抗生素更加敏感。吡咯类杀菌剂咯菌腈与二甲酰亚胺类作用机理相似，亦为信号传导抑制剂，但其对桃褐腐病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性均明显高于异菌脲和腐霉利，说明桃褐腐病菌对咯菌腈更加敏感。

本研究结果表明，苯并咪唑类、麦角甾醇抑制剂和二甲酰亚胺类对菌丝生长的抑制活性较强，但对孢子萌发的抑制活性较弱。因此，此类杀菌剂适宜推迟到发病初期菌丝生长阶段进行治疗应用；保护性杀菌剂、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和琥珀酸脱氢酶抑制剂对孢子萌发的抑制活性较强，但对菌丝生长的抑制活性较弱。因此，此类杀菌剂适宜在发病前期孢子萌发阶段进行预防应用；农用抗生素类四霉素和申嗪霉素以及吡咯类咯菌腈对菌丝生长和孢子萌发均具有很好的抑制活性。因此，此类杀菌剂适宜于在桃褐腐病菌各生育期用药。但是，同类杀菌剂不同品种间杀菌谱和杀菌特点可能存在较大差异，本试验测定的杀菌剂品种不能代表该类杀菌剂的全部品种，各类杀菌剂的其他品种对桃褐腐病菌的抑制特性有待进一步测定。

甲氧基丙烯酸酯类（QoIs）杀菌剂属于线粒体呼吸抑制剂，主要通过抑制细胞色素b与c1间的电子传递，从而阻断ATP产生而使细胞死亡。房雅丽等[6]发现，当正常的电子传递途径被抑制后，植物病原真菌可从旁路氧化途径获取能量。在田间，寄主植物会分泌（类）黄酮类物质抑制病原菌旁路氧化途径，而在培养基培养条件下，旁路氧化途径则不能被抑制。因此，室内测定时通常需在培养基中加入100 mg/L的水杨肟酸（SHAM）来阻止旁路氧化途径，但其前提是在此用量下水杨肟酸本身对该病原菌没有明显抑制活性，并且对旁路氧化途径能够有效抑制。该研究还发现，含量40～100 mg/L的水杨肟酸对大部分桃褐腐病菌菌丝生长具有明显的抑制作用，不适合用于桃褐腐病菌菌丝生长测定[6]；另外，60 mg/L的水杨肟酸虽不影响孢子萌发的最高浓度，但该浓度对旁路氧化途径的抑制程度尚无定论。因此本试验PDA培养基和WA培养基中均没有加入水杨肟酸，水杨肟酸对肥城地区桃褐腐病菌室内毒力测定中旁路氧化途径的影响数据有待进一步研究。

由于用药方式和用药环境不同，室内毒力测定结果与田间试验结果往往存在差异，本试验只测定了16种杀菌剂对桃褐腐病菌的室内毒力，其田间防效需进一步试验验证。褐腐病有2个发病高峰期：一个是花期，一个是果实成熟期。幼果期一般不发病，落花后被侵染的幼果只在表面出现肉眼可见的小斑点，待到果实成熟期才迅速表现发病症状，这种现象被称为“休止侵染或潜伏侵染”[2]，其休止侵染原因尚未见报道。休止侵染对田间药效试验也造成了困难，花期用药会影响授粉并且容易造成药害，谢花后用药又不能有效控制病菌花期侵染，只能提前到花露红时期用药。实践显示，北方桃褐腐病花期试验不容易调查试验结果。果实成熟前开展试验，只能控制病原菌再侵染，对果实内休眠后恢复活力的病原菌则很难发挥作用，并且容易造成采收桃农药残留超标。如何制定切实可行的桃褐腐病田间药效试验准则需进一步研究。

本试验测定的菌种为Monilinia fructicola，但引起桃褐腐病的病原菌至少有3种[1]，肥城地区是否存在其他2种病原菌以及杀菌剂对其他2种病原菌的毒力是否与本结果一致还有待进一步研究。

本试验只测定了药剂对菌丝生长和孢子萌发的抑制活性，对产孢量的影响也有待进一步研究。另外，本毒力测定均采用成品制剂，较之于原药测定更有利于指导田间应用，但制剂加工中的填料和助剂对测定结果可能存在影响，不同制剂加工技术对桃褐腐病菌的影响因子有待进一步测定。