改良全血DNA 提取法的质量与效度分析

左文博，王嘉政，徐 颖，杨小婷，倪 维，胡 松

（1. 江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056；2. 湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

基因组DNA 作为遗传物质，可用于遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等的早期确诊中［1］。DNA 的质量和纯度对于诊断结果的准确性有显著影响。DNA 与组蛋白构成核小体，核小体缠绕形成染色丝，染色丝与非组蛋白形成染色体，存在于细胞核中，外有核膜和细胞膜［2］。外周血提取DNA 的关键是分离出有核的细胞，通过破碎细胞膜和核膜，并去除细胞核中的非组蛋白和与DNA 结合的组蛋白，能获得较纯的DNA。目前有核细胞的分离方法有磷酸盐缓冲液洗涤法、低渗液洗涤法、PBS 冻融法、TE 缓冲液洗涤法、密度梯度离心法分离PBMC（peripheral blood mononnuclear cell，以下简称全血PBMC DNA 提取法）［3］。由于血细胞中含有PBMC、粒细胞、红细胞、血小板，而红细胞和血小板不含DNA，通过分离PBMC 防止全血中红细胞、血小板以及部分微生物DNA 干扰实验，因此分离PBMC 可以提高DNA 的质量。PBMC DNA 提取法相对简便，且分离后的细胞单纯，无其他外源性核酸的干扰，较为适合基因分型检测等实验操作［4］。

全血PBMC DNA 提取法，其原理是不同种类细胞颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带以获得较为纯净的有核细胞成分，从而提取高质量DNA，特别在淋巴细胞表型检测（如HLA、KIR 等）、器官移植中的淋巴细胞交叉配型、科研中某种单核细胞的培养和人体DNA 的抽提都广泛应用此方法［5-7］。目前在实验中，一般采取一次性提取大批量临床血液样本DNA，对于实验流程中提取DNA 的效能、实验时间、实验安全性、费用、设备要求和试剂等多种因素都有相应考虑。当在提取大批量临床血液样本过程中，全血PBMC DNA 提取法提取的实验时间过长、外周血样本需求量较多、DNA 纯度和质量偏低等问题尤为明显［8］。有研究［9］表明双蒸水低渗透压可帮助红细胞裂解，有利于外周血的快速DNA 提取。因此本研究尝试对已有试剂盒法改良，即使用双蒸水裂解红细胞配合试剂盒提取DNA，以下简称改良全血DNA 提取法。本实验通过比较两种方法提取DNA 的时间、质量、纯度和凝胶电泳检测结果来判断后者是否能有效减少提取DNA 时间以及通过减少外周血的使用量来提高DNA 提取率，从而运用于大样本实验。

1 材料与方法

1.1 样本

由湖北省中医院检验科筛选无基础疾病病史武汉地区人全血5 mL，通过EDTA 抗凝，- 40 ℃保存，总共80 份，随机分为两组，每组40 份，本实验志愿者均签署知情同意书，经湖北省中医院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 全血PBMC DNA 提取法 选用- 40 ℃保存的武汉地区健康人全血，电热恒温水槽加热，充分溶解，进行PBMC 细胞分离操作。采用Ficoll- hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法分离［10］，用淋巴分离液（天津TBD）分离PBMC 细胞，然后按照天根试剂盒（天根生化科技北京有限公司）说明书提取DNA。

1.2.2 改良全血DNA 提取法 选用- 40 ℃保存的武汉地区健康人全血，电热恒温水槽加热，充分溶解；洗涤：1 mL 全血加入0.5 mL 双蒸水，充分混匀后，8 000 r/min 离心3 min，弃上清液，重复3次，直至EP 管内液体红色消失，收集细胞，严格按照试剂盒说明书提取DNA。

1.3 基因组DNA 的检测

1.3.1 DNA 提取的耗时分析 多次记录DNA 提取时间，包括操作前准备时间、操作时间及试剂盒时间，并求得各部分平均值。

1.3.2 核酸蛋白定量仪检测 检测两种方法提取DNA 的浓度和纯度，比较两种实验方法获得DNA 的差异。取2 μL 所得DNA，以试剂盒中缓冲溶液作为空白对照，使用Thermo NanoDrop One 超微量分光光度计检测，读取DNA 浓度和OD260/OD280比值，重复3 次取平均值进行比较。计算每毫升全血对应提取的DNA 量，即记为提取DNA 的总质量。

1.3.3 体外PCR 扩增 以提取得到的基因组DNA 为模板，采用TIANLONG PCR Thermal Cycler仪进行体外PCR 扩增，用于后续琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA 质量。

12 μL PCR 反应体系：2× Taq 酶6 μL，ddH2O 2 μL，DNA 2 μL，引物MIX 2 μL，引物序列及产物长度见表1。PCR 反应条件：第一步，96 ℃变性2 min；56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，扩增5个循环；第二步，96 ℃变性25 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，扩增40 个循环；第三步,96 ℃变性25 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，扩增8 个循环；第四步,25 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 引物1 与引物2 对应引物序列Tab.1 Primer sequences of primer 1 and primer 2

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测 根据是否扩增出目的条带，判断两种方法提取的DNA 是否合格。将体外扩增后的产物进行2% 的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统（紫外分析仪）观察目的条带。

1.4 统计学分析

使用SPSS19.0 对两种方法所提取DNA 质量和纯度均值和进行独立样本t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法提取DNA 时间对比结果

改良全血DNA 提取法平均耗时60 min，PBMC DNA 提取法平均耗时145 min，全血提取DNA 时间显著少于PBMC DNA 提取法（见表2）。

表2 两种方法提取DNA 步骤及时间Tab.2 Steps and time of DNA extracted by two methods

2.2 核酸蛋白定量仪检测结果

用Thermo Nanodrop One 超微量紫外分光光度计测定两种方法所提取DNA 质量［11］，结果见表3。表3 结果显示，改良全血DNA 提取法提取DNA 质量（305.47 ± 151.64）ng 高于全血PBMC DNA提取法提取DNA 质量（116.47± 181.02）ng，t= 5.062，P< 0.05，差异具有统计学意义（图1a），说明改良全血DNA 提取法获得DNA 质量高于全血PBMC DNA 提取法；两种方法所提取DNAOD260/OD280值（1.77 ± 0.09）vs（1.90 ± 0.15），t= - 4.782，P> 0.05，差异无统计学意义（图1b），说明改良全血DNA 提取法提取DNA 与PBMC DNA 提取法提取DNA 纯度比较无明显差别。

表3 改良法和PBMC 法提取DNA 质量与纯度的比较Tab.3 Comparisons of the quality and purity between the improved method and PBMC to extract

图1 两种方法提取DNA 质量和纯度比较的散点图Fig.1 A Scatter plot comparison of the quality and purity of DNA extracted by two methods

2.3 凝胶电泳检测结果

两种方法所提取的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果发现，两种方法提取的DNA 条带光密度无明显差异，如图2 所示。图2 结果提示两种方法提取的DNA 均无损害，后期可正常投入使用。

图2 两种方法的凝胶电泳检测结果比较Fig.2 Comparison of the gel electrophoresis detection results of the two methods

3 讨论

从全血中提取高质量的DNA 是进行分子生物学实验的重要前提［11］。聚合酶链反应- 序列特异性引物法（PCR- SSP）是一种常用的分子生物学实验方法［12］，其原理是根据各个基因的核苷酸序列，设计出一套与每一等位基因都互相对应的引物，该引物只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，如HLA 分型、KIR 分型等大样本检测，这些检测对DNA 的产量和纯度要求较高［13］。使用PBMC DNA 提取法提取出来的DNA 纯度高，是实验室提取DNA 的主要方法，该方法从全血中分离出PBMC 细胞，再利用DNA 提取试剂盒获得高纯度的DNA。但因分离PBMC 细胞的操作繁琐、费时，在实际操作中，会导致核酸的损失而影响PCR- SSP 实验的结果［14］。

成熟红细胞无核，也无任何细胞器，无法提取出DNA，而白细胞中有核，可以提取出DNA。本实验利用红细胞在低渗溶液中极易裂解，而白细胞相对不易破裂这一特点，通过双蒸水迅速使红细胞裂解，而后离心取得白细胞沉淀，此法大大减少了红细胞裂解时间，克服了从PBMC 中提取DNA 繁琐的细胞分离步骤，能有效降低细胞损失，从而大大提高操作者的效率，在1 h 左右就可以提取出基因组DNA。由DNA 质量进行t检验可以看出，用改良全血DNA 提取法得到的DNA 质量显著高于用PBMC 方法提取得到的DNA 质量，说明改良法单位外周血DNA 得率更高，且反映纯度的OD260/OD280数值均在有效范围内（1.8 ～2.0），无明显的蛋白污染、DNA 降解或RNA 污染。改良全血DNA 提取法提取的DNA 用PCR 法扩增出的目的条带完整清晰，表明改良法未对提取的基因组DNA 造成额外损害。

综上所述，改良全血DNA 提取法与PBMC DNA 提取法相比更简单，效率更高，且PCR 无杂带，证明改良全血DNA 提取法并未受到外周血中其他来源DNA 的干扰。外周血DNA 提取依然是生物实验基础操作之一［15］，例如移植配型、KIR 基因多样性检测、DNA 序列的测定等。根据对改良全血DNA 提取法提取出的DNA 的质量和纯度的分析，该方法可提高单位体积外周血DNA提取效率，还可保证其纯度和DNA 不遭受多余损害。所以，本实验中的改良全血DNA 提取法是一种高效、经济的从全血中提取高质量DNA 的方法，当在大批量样本检测时比PBMC DNA 提取法更适合于PCR- SSP 的实验。