马尔尼菲篮状菌血流感染的实验室诊断

唐思诗，李 燕，陈知行，戴仲秋，敖科萍，何 超

马尔尼菲篮状菌(talarom-yces marneffei)原名马尔尼菲青霉菌(penicillium marneffei)，是一种条件性致病真菌，其动物宿主为竹鼠[1]，往往导致免疫低下人群感染[2,3]。近年来，随着免疫抑制药的使用和艾滋病患者的增多，马尔尼菲篮状菌病在临床愈发常见[4]，主要表现为肺、肝脏、脾脏、皮肤、淋巴结、骨髓和血流等局限型或播散型感染，以播散型感染最为常见[5-7]。研究发现，马尔尼菲篮状菌病患者6个月内病死率为11.3%～29.4%[8,9]，发生血流感染(Blood steam infection，BSI)的患者预后更差[10]，实验室应对该类疾病的诊治提供病原学依据，以改善患者预后。本研究拟建立马尔尼菲篮状菌BSI的实验室诊断路径，为该类疾病的诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 2012-04至2020-02在四川大学华西医院就诊的临床疑似发生真菌血流感染病例。本研究经四川大学华西医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂 XN 9000全自动血细胞分析仪(日本希森美康集团)；BacT/ALERT 3D全自动血培养仪(法国生物梅里埃公司)；Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统(郑州安图生物工程股份有限公司)；DNK A400全自动微生物联合检测仪(天津丹娜生物科技有限公司)。

瑞氏-吉姆萨染色液(珠海贝索生物技术有限公司)、革兰染色试剂(法国生物梅里埃公司)、乳酸酚棉蓝染色剂(为实验室制备)；沙保罗琼脂培养基(SDA)、土豆琼脂培养基(PDA)；质控菌株：马尔尼菲篮状菌CMCC(F)B33r。

1.3 方法

1.3.1 外周血细胞计数及血涂片镜检 使用全自动血细胞分析仪对患者血液样本进行血细胞计数和分析。将血细胞分析仪提示结果异常的血液样本混匀后推片，使用瑞士-吉姆萨细胞染液进行染色并置于光学显微镜下观察。

1.3.2 血培养

1.3.2.1 样本接种与培养 将患者血液样本分别接种于需氧和厌氧培养瓶，置于BacT/ALERT 3D全自动血培养仪，35 ℃孵育。5.0 ml注射器取报阳瓶中培养液进行涂片，革兰染色并镜检。如查见真菌菌丝或者孢子，按照血培养危急值流程报告临床。取培养液转种于2个SDA平板，分别置于28 ℃和35 ℃孵育。

对于村镇银行来说，我们主要从三个方面来讨论。首先，从村镇银行贷款业务的违约概率来看。我们假定村镇银行贷款业务的平均违约概率为P(0＜P＜1)，P值会受到监管部门监管强度的影响，随着监管强度θ的增加，村镇银行的选择会偏向更为优质的贷款客户，P值随之下降，下降的速率呈递减趋势并最终趋同于0。在监管强度超过一定程度θ*后P值将不再降低，表明村镇银行贷款的平均违约概率能够被监管强度上升改变的最高限度，即:

1.3.2.2 菌株的形态学鉴定 每日观察SDA琼脂的颜色变化和菌落形态特征。取SDA平板上含菌琼脂点种于PDA平板，置于28 ℃孵育，每日观察菌落的生长情况及形态特征，取生长良好的菌苔进行乳酸酚棉兰染色并镜检，观察镜下特征。结合菌株温度依赖型双相生长和菌落特征进行菌株鉴定。

1.3.2.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速鉴定菌种方法建立 使用无菌棉拭子挑取SDA平板上生长的菌苔，于30.0 μl 70%甲酸溶液制成菌悬液，取1 μl菌悬液滴加于质谱靶板孔位中，自然晾干形成菌膜；取1.0 μl HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶液均匀覆盖于菌膜表面，自然晾干后将靶板放入Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统仪进行检测；将待测菌所得蛋白质质谱峰数据与数据库内蛋白指纹图谱进行对比，分析得到鉴定结果及分值。种属鉴定的阈值分别为≥9.0和≥6.0，如果第一次检测分值<9.0，则重复进行第二次检测，取最高分值作为该鉴定菌株最终检测结果。

1.3.3 血清(1-3)-β-D葡聚糖检测(真菌G试验) 采用显色法对患者血清中的(1-3)-β-D葡聚糖进行检测。

1.3.4 观察项目 收集患者基础疾病、临床表现以及与血培养阳性标本同一时期送检的其他实验室指标，主要包括血浆CD4+T淋巴细胞百分比(CD4+T%)、血浆CD8+T淋巴细胞百分比(CD8+T%)、血浆CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞比值(CD4+T/CD8+T)、血浆降钙素原(PCT)等。分析病例诊治情况和临床结局指标(住院天数和住院病死率)。

1.4 统计学处理 本研究计数资料采用百分比(%)表示，正态分布资料采用均值表示，偏态分布资料采用中位数(四分位数)表示。

2 结 果

2.1 病例基本情况 本研究纳入马尔尼菲篮状菌血流感染病例24例，其中男21例，女3例，平均年龄42.2岁(20～55岁)，基础疾病均患有艾滋病。

图1 外周血涂片瑞氏-吉姆萨染色马尔尼菲篮状菌镜下特征(×1000)

2.3 血培养及分离株鉴定

2.3.1 血培养报阳液的革兰染色特征 血培养标本在仪器中孵育，平均报阳时间为(2.8±1.5)d，范围为0.5～4.5 d，将阳性瓶培养液进行涂片和革兰染色，镜下查见两头钝圆的腊肠形菌体(孢子相，图2A)3例(12.5%)，查见真菌菌丝体(菌丝相，图2B)21例(87.5%)。实验室立即按照血培养危急值流程报告临床：血培养报阳，查见真菌孢子和(或)菌丝。

图2 马尔尼菲篮状菌血流感染血培养阳性培养液革兰染色镜下特征

2.3.2 温度依赖型双相生长特性 将血培养报阳培养液转种SDA平板，如在28 ℃培养48～72 h观察到灰白色绒毛状菌落和产红色色素(图3A)，在37 ℃培养48～72 h观察到湿润平坦的淡褐色膜样的酵母样菌落(图3B)，则为温度依赖型双相生长试验阳性。

图3 马尔尼菲篮状菌在SDA平板孵育48～72 h的菌落特征

2.3.3 菌落形态特征 取2.3.2转种的SDA平板上菌苔点种于PDA平板，28 ℃不同孵育时间所见菌落特征图例如图4所示，培养期间取生长良好的菌苔进行乳酸酚棉兰染色，镜下查见：帚状枝，梗基上有3～6个瓶梗，瓶身膨大顶端变窄，有分生孢子，分生孢子链呈长弯曲状，孢子呈圆形或卵圆形(图5)。

图4 马尔尼菲篮状菌在PDA平板孵育不同时间的菌落特征

图5 马尔尼菲篮状菌在PDA平板孵育48 h(A)和72 h(B)后乳酸酚棉兰染色镜下特征(×400)

2.3.4 MALDI-TOF MS鉴定马尔尼菲篮状菌 我们对9例SDA平板上生长48 h后的菌苔进行了MALDI-TOF MS检测，然后将待测菌株蛋白质峰与数据库内蛋白指纹图谱进行比对。9例分离株均鉴定为马尔尼菲篮状菌。待测菌株蛋白质峰与数据库内蛋白指纹图谱进行比对图例如图6所示。

图6 MALDI-TOF MS用于马尔尼菲篮状菌鉴定结果质谱峰

2.4 真菌G试验 8例进行了血清真菌G试验检测，其中5例阳性(62.5%)，3例阴性(37.5%)。

2.5 其他实验室指标 本研究收治入院治疗的患者16例，血浆CD4+T%均显著降低(平均值3.2%，参考值33.2%～47.9%)，血浆CD8+T%均增高(平均值57.1%，参考值20.4%～34.7%)，CD4+T/CD8+T均显著降低(平均值0.08，参考值1.0～2.3)，血浆PCT均增高(平均值10.9 μg/ml，参考值<0.05 μg/ml)。

2.6 病例诊治过程和临床结局 本研究24例血培养均查见马尔尼菲篮状菌，可同时结合外周血细胞计数、血涂片镜检、真菌G试验及感染相关实验室指标，进行马尔尼菲篮状菌BSI实验室诊断，诊断路径如图7所示。

图7 马尔尼菲篮状菌血流感染的实验室诊断

16例住院患者中,13例(81.3%)出现不同程度的发热，10例(62.5%)具有呼吸系统症状，12例(75.0%)继发细菌和/或真菌感染，包括肺部感染8例和血流感染4例。患者住院中位时长为12.0 d,范围为1.0～64.0 d，7例(47.7%)好转出院，9例(52.3%)死亡。

3 讨 论

马尔尼菲篮状菌是温度依赖型双相真菌，可引起艾滋病患者及其他免疫缺陷病患者继发深部真菌感染。研究表明早期、足量、有效的抗真菌治疗可以改善马尔尼菲篮状菌病的结局[11]。

本研究通过病例外周血细胞计数、血培养及真菌G试验和临床资料建立了马尔尼菲篮状菌BSI的实验室诊断路径如图7所示，在实际工作中，应依据实验室条件进行方法学选择，如缺乏质谱仪，可仅进行基于菌株形态学鉴定的路径。本实验室尚未开展常规真菌核酸测序检测，有报道显示，基因测序在丝状真菌感染中也得到广泛应用[12,13]，如患者高度怀疑为该类感染，但血培养阴性，可考虑建立基于核酸的分子生物学方法，可提高检测灵敏度，也可缩短样本检测时间。

马尔尼菲篮状菌BSI，外周血细胞计数仅仅是一种初筛方法，且与外周血中的菌量密切相关，本研究纳入病例中也仅有1例外周血涂片查见疑似病原菌。同时，外周血涂片镜检还可鉴别诊断和马尔尼菲篮状菌病临床表现相似的另一种温度依赖型双向真菌，即荚膜组织胞浆菌[14]。

血培养是马尔尼菲篮状菌血流感染实验室诊断的重要依据[15]，普通实验室应掌握本研究结果部分详述的形态学鉴定特征。另外，本研究纳入病例的血培养标本平均报阳时间为2.0 d，报阳曲线有时并不呈现典型的S形生长曲线，容易被误认为是假阳性曲线，提示针对疑似发生真菌血流感染的病例，血培养生长曲线的参考价值有限。我们发现，针对这类病例血培养报阳培养液的涂片、革兰染色及转种，如采用2.0 ml针管会造成针头堵塞，可能导致假阴性结果，因此推荐使用5.0 ml粗针管进行涂片和平板接种。特别提醒，马尔尼菲篮状菌为温度依赖型双相真菌，是篮状菌属中可引起人体深部真菌感染的条件致病菌，我国卫生部2006年公布的《人间传染的病原微生物名录》中将其危害程度归于第三类[16]，因此所有样本检测操作应在Ⅱ级生物安全条件进行，操作过程中应避免孢子飞散，接种后可使用透明胶带密封平板再孵育，样本和菌株使用后应高压灭菌后按照废弃污染物处理。

近年来，MALDI-TOF MS具有操作简单、快速、准确性高、可重复性高的特点，往往数分钟即可对单个样本进行准确的菌种鉴定，已广泛应用于病原菌鉴定[17]，它是一种通过比对特征性蛋白指纹图谱对微生物进行快速有效鉴定的蛋白质组学技术[17,18]。我们依据实验室质谱仪和丝状真菌鉴定技术开展情况，对9例病例分离株进行复苏和菌种鉴定，鉴定结果均为马尔尼菲篮状菌。有质谱仪的实验室可以使用该方法对马尔尼菲篮状菌进行快速鉴定，辅助疾病早期诊断。

血清真菌G试验主要检测酵母菌和丝状真菌细胞壁的真菌(1-3)-β-D 葡聚糖，该多糖成分具有较高的特异性，可作为人体深部真菌感染的标志[19]。有研究认为真菌G试验具有辅助诊断血培养确诊合并播散性马尔尼菲青霉菌病的临床应用价值[19]，阳性率为48.2%～80.0%[19-21]，本研究中回顾性分析发现8例患者进行了真菌G试验检测，阳性率为62.5%，但由于样本量较小，有待于进一步扩大样本分析。

本研究纳入的16例住院患者中，主要临床表现为发热和呼吸系统症状，部分免疫学指标异常(CD4+T%显著降低，CD+T8%增高，CD4+T/CD8+T显著降低)，75.0%患者继发了细菌/真菌的感染(又以肺部感染为主)，住院中位时间为12.0 d，住院病死率较高(52.3%)，这可能与患者机体免疫功能差、基础疾病和治疗效果等有关，针对该类患者在进行基础疾病和支持治疗的同时，应尽早针对原发和继发感染进行诊治，以改善患者预后。

综上所述，马尔尼菲篮状菌BSI的实验室诊断应综合外周血细胞计数、血培养、真菌G试验以及临床资料综合分析，这类病例免疫力差，易继发感染，预后较差。