赤霉素介导下植物对重金属的耐性机理

张春雨,王海娟,王宏镔

(昆明理工大学环境科学与工程学院,云南 昆明 650500)

近年来,重金属污染对土壤环境的胁迫不断增强,对农业生产造成了不可忽视的负面效应。土壤环境中毒性较强的重金属元素有铜(Cu)、锌(Zn)、铅(Pb)、铬(Cr)、镉(Cd)、汞(Hg)以及类金属砷(As)等[1]。重金属污染会对植物生长产生不利影响,如使植物正常生长发育受阻,生物量降低,光合作用受到抑制,活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生,有时甚至对植物细胞内的DNA、蛋白质、脂类等物质造成干扰和破坏。有些重金属还易被农作物吸收,对人体健康构成潜在风险[2]。

通过不断进化与自然选择,植物发展出了抵御重金属毒害的防御机制,一方面阻止根部吸收重金属或减少重金属向地上部运输,避免其进入植物内部;另一方面植物不断调整生长状态,通过维持各生理生化过程的正常运作,包括水和养分的吸收、光合作用的维持、呼吸和蒸腾作用的调整等方法提高对重金属的耐性[3]。植物激素是具有调控植物生长、代谢、应答功能的重要物质,虽然含量甚微,但具有强大的生理调控能力。植物可通过主动调节内源激素水平来缓解重金属胁迫。而通过外源添加某些植物激素,可改善植物对重金属的耐性,如外源生长素(indole-3-acetic acid,IAA)可减缓Cu对豌豆的毒害作用[4],外源水杨酸(salicylic acid,SA)可降低Cd对睡莲(Nymphaeatetragona)的胁迫[5]。此外,一些植物激素还可增加植物对重金属的富集能力[6]。

1 GA提高重金属胁迫下植物生物量,保护根系生长

重金属降低植物营养代谢功能，致使其生物量降低。虽然有些重金属元素为植物生长发育所必需,但超过一定浓度后便抑制植物生长。超富集植物提取修复(phytoextraction)一般仅适用于中、轻度污染土壤。如果土壤重金属含量过高,会阻碍植物生长发育,甚至引起植物死亡。GA具有延长茎秆、促进叶片膨大的功能，在重金属胁迫下同样可维持植物正常生长,并有助于提高植物生物量,而更高的生物量意味着单个植株可贮存更多的重金属。

在Pb污染土壤中,叶面喷施10-6mol·L-1GA3可增加玉米(Zeamays)株高、根长以及地上部和地下部干重,促进单个植株对Pb的吸收。HADI等[15]认为该现象与玉米根系伸长和生物量增加有关。在含有1.0 mg·kg-1Cd(NO3)2的污染土壤中,叶面喷施GA3可显著增加龙葵生物量,其地上部Cd含量增加16%,植株Cd吸收量增加124%[14]。GA提高植物对重金属的富集能力可能是提高植物根系发达程度(根部生物量)和提供更多蓄积位置(地上部生物量)共同作用的结果。一方面,更为发达的根系意味着可吸收养分的土壤体积增加,这有助于植物吸收更多营养物质或重金属;另一方面,更高的地上部生物量将为重金属提供更多的积蓄位置,避免重金属过于聚集,从而降低其对植物生理生化过程造成的负荷[16]。

关于重金属胁迫下GA提高植物生物量的机制,最近有研究从相关基因表达及细胞内部结构变化的角度给出了一些解释。GA通过直接介导纤维素聚合物的生物合成影响植物细胞壁的发育,如外源添加5 μmol·L-1GA可使高粱(Sorghumbicolor)初生细胞壁的CESA基因(CESA1、CESA3及CESA6)表达的差异倍数上升,正向调控部分特定纤维素合成酶基因的表达,该结果揭示了GA与纤维素合成的关系[17]。此外,HUANG等[18]也提出MYB转录因子通过GA介导的DELLA-NAC(SLR1)信号直接调控CESA的转录。需要注意的是,植物激素间可通过交叉反应(crosstalk)调控细胞壁纤维素的生物合成。如QUE等[19]发现在胡萝卜(Daucuscarota)叶柄细胞中,油菜素内酯(brassinosteroid,BR)通过调节内源活性GA的水平完成纤维素的沉积。而作为细胞壁的重要组成,纤维素对缓解重金属胁迫还具有更重要的意义,如阻止重金属离子跨膜进入原生质体,并在重金属离子的吸收、固定及区隔化过程中发挥重要作用。如经过Cd处理的秋华柳(Salixvariegata)根、茎细胞的细胞壁在去除果胶和半纤维素后,仍含有一定量的Cd,因此除了木质素和结构蛋白以外,一部分的Cd离子极有可能被纤维素固定[20]。而在Pb和Cd共同胁迫下,细胞壁中的纤维素对金盏菊(Calendulaofficinalis)根部细胞壁毒害效应的减缓也具有较大贡献。研究者认为,Pb和Cd胁迫通过改变细胞壁组分纤维素的分布特性和排列方式(形成—CH垂直于细胞轴、分子间氢键—OH平行于细胞轴的存在状态)来调控细胞壁官能团特性,并在此过程中不断提高金盏菊根部适应Pb和Cd胁迫的能力[21]。虽然尚未有细胞壁纤维素调控和GA诱导的抗重金属胁迫之间存在关联性的直接证据,但并不能完全排除GA通过对纤维素的影响而抵抗重金属胁迫的可能性。

2 GA有助于清除活性氧,提高植物抗氧化能力

ROS包括超氧化物(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O2),是一类重要的信号物质,介导植物发育、重力感应以及细胞程序死亡[22]。然而重金属与硫醇的结合会破坏植物细胞内氧化还原状态的动态平衡,增加ROS,使植物细胞中蛋白质和细胞膜脂过氧化水平提高[23]。此外,有证据表明植物细胞氧化还原状态的失衡会导致植物内源激素合成紊乱。如YANG等[24]发现Cd2+使栾树(Koelreuteriapaniculata)细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性下降,而内源GA含量从31.84 μg·kg-1降低至23.74 μg·kg-1。植物对ROS的清除依赖于酶促和非酶促抗氧化系统。SOD、CAT、POD和参与抗坏血酸(ASA)-谷胱甘肽(GSH)循环的关键酶(如抗坏血酸过氧化物酶、脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶等)是维持ROS平衡的重要抗氧化酶,而非酶抗氧化剂主要包括植物体内ASA-GSH循环的中间代谢物[25]。GA可有效降低植物细胞的过氧化程度并保护植物细胞的膜结构。如在Cd胁迫下,施用100 μmol·L-1GA3可使绿豆(Vignaradiata)细胞中H2O2减少并保持丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量稳定[26]。这是因为GA调节酶促及非酶促抗氧化系统,降低ROS造成的过氧化,维持细胞内氧化状态的动态稳定,降低重金属胁迫[27]。

在暴露于200 μmol·L-1CuCl2中的豌豆(Pisumsativum)植物组织细胞中存在大量MDA和羰基,但在培养基中加入1 μmol·L-1GA3后,其抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和愈创木酚过氧化物酶活性几乎恢复到正常水平[4];GANGWAR 等[28]发现添加10 μmol·L-1的GA可有效缓解Cr胁迫下豌豆地上部和根部CAT活性被抑制的现象;同时,10 μmol·L-1的GA还可有效维持豌豆幼苗中ASA和GSH总量,更为有效地稳定了细胞内的氧化还原状态。在100 μmol·L-1的Cd、Cu和Pb胁迫下,10 μmol·L-1GA3可有效降低小球藻(Chlorellavulgaris)中H2O2与MDA含量,增加ASA与GSH总量,提高SOD、CAT及抗坏血酸过氧化物酶活性[27]。这些结果均表明强化酶促及非酶促抗氧化系统是GA增强植物抵御重金属胁迫能力的关键机制之一。

3 GA促进光合系统的修复

重金属胁迫会降低植物叶片中叶绿素含量,但GA可增加植物叶绿素含量,保障光合作用的正常进行。如在50 mmol·L-1Ni胁迫下,小麦中叶绿素含量(鲜重)由2.52 mg·g-1降低至1.23 mg·g-1,但添加10-6mol·L-1GA3可使叶绿素含量回升至3.26 mg·g-1[11];在小球藻受Cd、Cu和Pb胁迫时,10 μmol·L-1GA3可显著增加其叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量[27];AHMAD等[29]认为GA诱导叶绿素和类胡萝卜素含量上升是由于其改善光合色素质体形态发生(morphogenesis)所致。而叶绿素和类胡萝卜素含量的增加极大增强了重金属胁迫下植物光合作用的能力。

光合作用过程涉及的电子、蛋白质以及酶对反应环境要求十分严苛,但重金属离子会对这些物质产生干扰,降低光合效率[30]。关于重金属胁迫下GA强化光合作用的相关机制已有报道。相关研究证实,高等植物内源GA水平与光合活性呈正相关,内源GA的升高可提高光合活性。而在重金属胁迫下,GA对光系统同样具有保护功能。如在高浓度Cu2+环境中,GA增加了向日葵叶片细胞中光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ,PS Ⅱ)反应中心的能量捕获,同时增加了外周天线复合体Ⅱ(light harvesting complex Ⅱ,LHCⅡ)的稳定性,提高了净光合速率(PN)和PS Ⅱ原初光能转化效率(Fv/Fm)[31]。最近,AHMAD等[29]认为GA除可增加PS Ⅱ反应中心的能量捕获外,还会提高天线分子向PS Ⅱ反应中心的能量传递效率,更大程度上刺激其活性。GA还可以通过对光合酶的影响增强植物光合作用效果,提高叶面积指数和光截留量,提升光合效率,改善PS Ⅱ的活性[32]。此外GA可增加光合产物的源强(source potential)和再分布(redistribution),进而增加光合产物的库强度(sink strength)[33]。GURURANI等[31]还认为GA介导下光合作用的改善可能是由于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的增加进而刺激Rubisco亚基的合成所致。

另有研究表明,除直接参与光合系统的修复外,GA还可以通过减少ROS和以DELLA蛋白为媒介的方式改善光合作用。由重金属诱导的ROS会影响光合作用中酶的正常功能,破坏光合膜系统并抑制PS Ⅱ效率,而GA可通过减少ROS的产生缓解该现象[34]。其次,相关实验证实DELLA蛋白可通过对GA的响应来保障光合作用。叶绿体外膜的蛋白前导入机制核心由TOC75蛋白传导通道以及导入受体TOC33和TOC159组成,GA对DELLA蛋白的降解在叶绿素和类胡萝卜素的生物合成中起关键作用,可调控叶绿体的分裂和叶肉细胞中叶绿体基粒的堆积。当GA浓度较低时,RGL2蛋白(一种DELLA蛋白)积累,翻译后修饰机制通过限制TOC复合物水平上叶绿体蛋白的导入,使叶绿体发生受阻;当GA积累到较高浓度时,DELLA蛋白被降解,TOC159可立即装配到TOC复合物中,这使得光合作用相关蛋白完全进入叶绿体,进而增强光合作用[35]。DELLA蛋白的积累还保持了光合膜的完整性,从而更好地保护放氧复合体的Mn簇,增加PS Ⅰ循环电子传递能力[30]。

在单因素试验的基础上，以百香果酸奶感官评分为响应值，利用Design-Expert.V8.0.6进行PB试验的设计试验设计如表1所示。

4 GA与重金属区隔化

植物可通过将重金属滞留在细胞壁间或液泡区隔的方式降低重金属毒性。植物细胞壁在其表面提供负电荷位点结合重金属离子,限制其跨细胞膜转运,但这种方法受到重金属浓度的限制。液泡是大多数植物细胞中重金属的主要储存场所,重金属通过与植物螯合素(phytochelatin,PC)结合进入液泡,并以有机配体-重金属配合物的形式储存于其中。目前有研究发现GA可改变植物细胞中重金属的分布。如HE等[36]发现10 μmol·L-1GA3使黑麦草(Loliumperenne)细胞壁Cd含量增加35%～60%,可溶部分和细胞器中Cd含量分别减少4%～14%和23%～45%,并使Cd富集量从0.19 mg·盆-1升高至0.25～0.34 mg·盆-1。重金属的液泡区隔化是主要解毒途径,过量的Cd以Cd-PC复合物或Cd-谷胱甘肽(Cd-GS)复合物的形式,通过碳纳米管结合盒转运体(ABC转运蛋白)转运到液泡中,而Cd2+通过Cd2+/H+逆向转运或阳离子扩散促进因子家族转运体转运。此外,在750 mg·kg-1Pb胁迫下,叶面喷施1～10 μmol·L-1GA3可显著增加Pb在黑麦草叶片细胞壁中的比例,减少Pb在可溶组分和细胞器中的占比,Pb富集量也升高44%～135%。这些结果表明,重金属区隔化是GA介导下植物解毒的重要机制之一[13]。

重金属区隔化常会导致其化学形态转变,而重金属的生物毒性与其形态关系密切。如对Cd而言,无机和有机水溶态比不溶性磷酸和草酸结合态更为有害。HE等[36]的研究表明,GA3在改变黑麦草细胞中Cd分布的同时,还改变了其不同化学形态占比。其他研究者也得到相似结论:GA3在低浓度(1～10 μmol·L-1)时,黑麦草将Pb积蓄在细胞壁中,不易迁移的Pb形态比例也会升高[13]。而这种重金属化学形态的变化有助于降低重金属对植物的毒性,进而增强植物对重金属的耐性。

5 重金属胁迫下GA信号传递与多种激素间交叉反应

植物激素间存在相互控制的反馈调节机制,而重金属胁迫会导致多种激素含量发生变化。如Cr胁迫下玉米中GA含量降低,这种抑制效果同样表现为玉米素(zeatin,ZA)和IAA含量降低,脱落酸(abscisic acid,ABA)含量则显著提高[37]。在Cd胁迫下,低Cd积累基因型小麦中GA、IAA及玉米素核苷(zeatin-riboside,ZR)含量下降,ABA含量上升[38]。有研究表明,外源补充GA会促使其他激素含量改变,提高植物对重金属的耐性。例如,50 μmol·L-1AlCl3会抑制黑麦(Secalecereale)根尖中植物激素分泌并破坏各激素间的平衡,导致GA与ZR含量下降,IAA和ABA含量上升。而ABA/GA和IAA/GA值增加还抑制了黑麦根系的生长。HE等[39]通过增加GA含量,促使各激素相互调节,使IAA/ZR和GA/ZR值升高,最终缓解了Al胁迫。

植物激素的分子信号传递是激素控制植物生长以及调节其他激素的重要桥梁。GA是如何引起一系列的生理学效应并将信号传递给下游的?GA信号通路的揭示提供了一个有参考价值的线索[40]。目前对GA信号传递的公认描述是GA-GID1-DELLA调控模块的分子基础和进化模式,即GID1蛋白与GA结合并改变分子构象,形成的疏水表面与DELLA蛋白结合形成GA-GID1-DELLA复合体。该复合体中DELLA蛋白C端与SCFSLY1/GID2/SNE相互作用,经26S蛋白酶识别并降解[41]。在该调控模式中,DELLA蛋白通过与植物色素相互作用因子PIF4的转录因子DNA识别域结合来抑制细胞的伸长,负向调节植物生长[42]。更为重要的是,DELLA蛋白还是GA与其他植物激素发生交叉反应的关键节点,对重金属耐性具有十分重要的调节功能[43]。

环境胁迫会导致ABA积累并诱导抗性基因的表达。例如在Zn胁迫下,灰杨(Populuspruinosa)的黄色条纹家族蛋白2(YSL2)和植物镉抗性蛋白2(PCR2)的基因转录水平升高,但外源添加ABA可对其产生有效抑制并缓解Zn对灰杨的胁迫[44]。有研究证实,DELLA蛋白在ABA-GA交叉反应中起重要作用。RING-H2锌指因子XERICO是公认的DELLA目标之一,可促进ABA的积累并与GA产生拮抗作用[45]。在水稻中,ABA还诱导GA抑制WRKY因子OsWRKY51 和OsWRKY71 连接糊粉蛋白细胞中的信号,从而支持这2种激素交叉反应[46]。外源添加10 μmol·L-1GA3可显著改善瑞香(Daphnejasminea)对Ni胁迫的反应,WISZNIEWSKA等[47]发现该现象是由于过氧化物酶体反应刺激改变内源性茉莉酸(jasmonic acid,JA)的合成所致。一些植物中GA与JA的拮抗机制已被阐明,如在水稻中GA-JA拮抗反应与SLR1蛋白介导的GA信号通路抑制有关[48]。OsJAZ9 蛋白与SLR1 蛋白(一种重要的DELLA蛋白)可以发生相互作用,由此导致GA与JA表现为拮抗关系[49]。此外,之前的研究还认为COI1 编码一种F-box蛋白——SCFCOI1E3泛素连接酶蛋白,具有调节JA和感知信号的功能[50]。对模式植物拟南芥的研究发现,GA3通过调节拟南芥的生长素转运和信号转导,增强了根系对外源生长素的响应能力。GA3可以根据生长素信号突变体的根系伸长和反应性报告基因的表达来调节生长素信号,增加了根分生组织和伸长区DR5∷GUS及IAA2∷GUS的表达。进一步研究表明,GA3可通过AUX1 和PIN 蛋白促进生长素的转运[51]。

植物激素间的交叉反应十分复杂,除上述以DELLA蛋白为核心的机制以外,一些气体信号分子(如一氧化碳、一氧化氮和硫化氢等)和一些microRNAs(miRNAs)也具有激素间信号传递的功能,共同协调各激素以缓解重金属胁迫。如一氧化氮降低豇豆(Vignaunguiculata)的ABA含量,并促进包括GA在内的其他植物激素水平含量,以提高其对Pb的耐性[52]。BANERJEE等[53]报道了GA下调小麦糊粉层细胞中半胱氨酸脱硫酶的表达并抑制硫化氢的生成,进而影响内源GSH的产生,提高抗氧化系统活性并阻止糊粉层细胞程序性死亡。除了气体信号分子,一些miRNAs同样具有激素间信号传递功能，如GA通过miR159、miR156 和miR396 等与其他植物激素发生交叉反应[54]。

6 结论与展望

6.1 结论

赤霉素除具有调控植物生长发育的功能外,还可增强植物对重金属的耐受性并提高其对重金属的吸收量。而赤霉素介导下植物对重金属的耐性机理主要包括植物生物量维持、抗氧化作用增强、光合系统修复、重金属区隔化和信号传递等。面对重金属污染,赤霉素可通过这些途径对胁迫作出响应,如通过调整抗氧化酶的活性以保护细胞膜结构和功能免受活性氧自由基的伤害;在光合系统中,通过提高叶绿素含量而使植物在重金属胁迫下能正常生长;通过改变重金属离子在植物细胞壁和细胞器中的分布而使其对重金属离子实现区间隔离和解毒等。此外,GA可调控部分特定纤维素合成酶基因的表达以促进纤维素的生成,并通过DELLA蛋白、气体信号分子和miRNAs与其他植物激素发生交叉反应,进而调节植物对重金属的耐性。

6.2 展望

6.2.1重金属胁迫下GA的合成及分解机制有待深入研究

在高等植物中,赤霉素合成途径可根据参与酶的种类及在细胞中不同合成位置分为3个阶段:首先,牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸在古巴焦磷酸合成酶和内根-贝壳杉烯合成酶催化下形成内根-贝壳杉烯;然后,内根-贝壳杉烯在内根-贝壳杉烯氧化酶和内根-贝壳杉烯酸氧化酶作用下形成GA12-醛;最后,GA12-醛经GA20氧化酶(GA20ox)、GA3氧化酶(GA3ox)和GA2氧化酶(GA2ox)作用转变为其他种类的GA。已有文献报道,重金属胁迫会导致遗传物质损伤并降低基因组模板稳定性,导致内源GA含量降低[55]。但重金属对GA合成代谢途径中哪些基因片段造成了影响或损伤?GA2ox、GA3ox及GA20ox是GA合成过程中重要的氧化酶基因,在重金属胁迫下它们的转录与表达变化调节机制如何?这些问题目前鲜见文献报道。

6.2.2GA提高植物耐受重金属的相关机制需要更为深入的研究

目前关于GA提高植物对重金属耐性或增加植物富集能力的研究大多只关注于富集重金属量的多少,对其生理过程尤其分子机制的研究相对较少。如GA如何调动抗氧化酶系统应激、其中的信号转导机制如何、有无其他激素参与等问题。此外,针对GA介导下植物细胞形态学上变化情况的研究也不多见。如GA可以增强小麦在Cd胁迫下的光合作用,提高光合速率,增加气孔导度。而目前认为,Cd对光合系统的毒性与气孔密度的改变、光合放氧和类囊体超微结构的变化有关[31]。因此,包括GA在内的植物激素是否会改变叶绿体的组装和结构具有重要的研究价值。此外,扫描电镜和红外热像分析还表明,GA信号通路重要赤霉素受体GID1(gibberellin-insensitive dwarf 1, GID1)参与到叶片气孔调节,而其中相关细胞器的结构变化及相关分子机制还有待进一步探明[45]。

6.2.3重金属胁迫下GA在植物激素调控网络中的功能和机制研究需要进一步完善

如前所述,植物激素调节网络是一套庞大而复杂的应激系统,遗传物质和各类信号分子均参与其中。如GA3能逆转三唑类化合物的形态和胁迫保护作用,其自身的信号机制受乙烯影响,而乙烯则被认为与植物激素之间存在交叉反应[33];BR显著诱导了GA生物合成基因之一D18/GA3ox-2的表达,导致水稻幼苗中GA1水平升高。当感受到过量活性BR时,激素主要通过上调GA失活基因GA2ox-3来诱导GA失活并抑制BR的生物合成[56];OsbHLH148和OsPIL14分别编码控制JA和GA反应的关键转录因子,使两者拮抗表达[49]。此外,GA-GID1-DELLA复合物还与第二信使和其他植物激素相互作用,整合环境和内源信号通路,控制植物激素的稳态和其他生物进程[57]。由于植物激素网络的复杂性,在重金属胁迫下GA调控植物激素网络的研究并不多见。在重金属的影响下,哪些激素会发生变化,相应的基因又会如何表达?表观遗传因子以及非编码RNA是否在交叉反应中发挥作用?这些分子水平上的作用机制目前鲜见报道,而这些方面的深入研究有望揭示重金属胁迫下GA的作用机制。

6.2.4GA对植物修复效率的影响需要继续探索

外源施加植物激素的浓度、持续时间、喷施方式等众多因素对植物的生理活动均会造成不同影响,喷施不当有时反而会降低植物对重金属的耐性或富集量。比如豌豆在受Cr污染的情况下,施用浓度为10 μmol·L-1的GA3可保持豌豆种子的萌发率,提高生物量,保持总蛋白和营养物质含量,维持氮素循环和氧化还原状态稳定,但当GA3浓度为100 μmol·L-1时却得到了相反效果[28];1～10 μmol·L-1GA可增加黑麦草对Pb的富集,但100 μmol·L-1GA反而使其生物富集系数从对照组的1.2降至0.91[13]。植物修复技术因受植物生长缓慢、生物量小、修复效率低等问题困扰[58],外源施加植物激素是一种简单有效且无副作用的绿色修复方式,不失为一种弥补植物修复能力不足的解决方案。但具体植物所对应的GA最适浓度和喷施方式等信息还需要大量研究来确定。此外,多种植物激素联合使用已被证实是一种有效增加植物修复效率的措施。如向言词等[59]使用IAA与GA或6-苄基腺嘌呤联合作用协同强化芥菜型油菜(Brassciajuncea)和甘蓝型油菜(B.napus)富集Cd的能力;吴东墨等[60]通过生长素与激动素配合施用,增加了蜈蚣草(Pterisvittata)对As的富集。然而其他植物激素与赤霉素复合施用在植物修复中的效果还需要进一步深入研究。

致谢:感谢昆明理工大学环境科学与工程学院博士生导师、美国马萨诸塞大学博士后张迪教授润色英文摘要。