褐藻酸降解菌生长及产酶条件研究

2020-12-23董砚博

农业科技与装备 2020年6期

关键词：试验

董砚博

摘要：为确定褐藻酸降解菌的最佳生长及产酶条件，以菌株AGN12为研究对象，根据发酵液的生物量和上清液的酶活力，分析碳源、氮源、培养时间、培养基初始PH值、培养温度对酶解效果的影响。试验确定的最佳产酶条件为：以0.7%海藻酸钠为碳源，以0.3%硫酸铵为氮源，培养温度30 ℃，培养基初始pH值8.0，培养时间24 h。

关键词：降解菌;褐藻酸;试验;寡糖;酶活力

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2020）06-0050-03

海带是我国产量最高的海藻类生物，富含褐藻酸盐（alginate）类多糖聚合物。褐藻酸降解菌能分泌褐藻酸酶，使褐藻酸多糖转化为具有多种生物活性的寡聚糖，诱导植物产生抗性反应并增强抵抗力。为此，从腐烂的海带汁中筛选和分离得到菌株AGN12，利用其体内的酶水解褐藻酸盐，采用单因素试验研究其生长条件和产酶条件，旨在为利用酶法降解褐藻酸多糖生成有活性的寡糖提供工艺参数。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

将新鲜海带破碎后，置于三角瓶中发酵数天，得腐烂海带汁，通过发酵、富集、培养、选择、分离得到AGN12菌。

碳源为褐藻酸，产自上海埃彼化学试剂有限公司;氮源为蛋白胨和酵母浸粉，产自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;硫酸铵产自上海埃彼化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-F 全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;HPX-9082ME数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂;722-分光光度计：上海精密科学仪器有限公司;TDA-8002 恒温水浴锅：余姚市肖东仪器厂;TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 不同碳源对生长和产酶的影响在基础培养基的基础上调整碳源，即分别添加浓度均为0.6%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、海藻酸、微晶纤维素、果糖、甘露糖和山梨糖，配制含有不同含碳化合物的培养基。然后按3%的接种量接入菌液，于30 ℃液体培养16 h后，测定发酵液的生物量和上清液的酶活力。

1.3.2 不同氮源对生长和产酶的影响在含0.6%褐藻酸基础培养基的基础上调整氮源，分别添加浓度均为0.2%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、酪蛋白水解物、硝酸铵和硫酸铵，配制含有不同含氮化合物的培养基。按3%的接种量接入菌液，于30 ℃液体培养16 h后，测定发酵液的生物量和上清液酶活力。

1.3.3 培养温度对生长和产酶的影响按3%的接种量接入基础培养基中，分别在20，25，30，35 ℃下液体培养16 h，测定发酵液的生物量和上清液酶活力。

1.3.4 培养基初始pH值对生长和产酶的影响将生长基础培养基的起始pH分别调至3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0。然后按3%的接种量接入菌液，30 ℃液体培养16 h，测定发酵液的生物量并测定上清液的酶活力。

1.3.5 培养时间对生长和产酶的影响在上述最佳产酶条件下，按3%的接种量培养菌体，前24 h内每隔2 h取样，24 h后每隔12 h取样，测定发酵液的生物量和酶活，确定最佳发酵时间。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对生长及产酶的影响

不同碳源对AGN12菌生长及产酶的影响见表1。

由表1可知：AGN12菌对不同碳源的利用有很大差别，以海藻酸作为碳源时，菌体生长最好，酶活力最高，即产酶量最高;用酵母浸粉、甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖做碳源时，菌体生长缓慢，产酶量也较低，说明AGN12菌对这几种碳源的利用效果不好;以山梨糖、CMC、可溶性淀粉、蔗糖为碳源时，菌体不生长，也检测不到酶活。由此可以得出结论，海藻酸钠是最佳碳源。

2.2 不同氮源对生长及产酶的影响

不同氮源对AGN12菌生长及产酶的影响见表2。

由表2可见：在含有机氮源牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物的培养基中，AGN12菌能迅速生长并具有较高的产酶能力;在含蛋白胨、酵母浸粉的培養基中，AGN12菌也能迅速生长并具有一定的产酶能力;在含有无机氮源硫酸铵、硝酸铵的培养基中，AGN12菌的生长情况不及含有机氮源的培养基，但以硫铵为氮源时，AGN12菌具有很高的产酶能力。从空白来看，AGN12菌在不含任何氮源的培养基中能迅速生长并有较高的产酶能力。将空白与含有机氮源培养基培养产酶情况相比较，发现部分有机氮源抑制菌产酶。

2.3 培养温度对生长和产酶的影响

受试验条件限制，仅选择20，25，30，35 ℃共4个温度进行试验，结果见图1。

由图1可知，从20 ℃开始，随着温度的升高，细菌生长情况良好，酶活不断增强。测裂解酶酶活即粘度发现，20 ℃和25 ℃的产酶情况相差不大，而另一酶活指标还原糖生成量随温度升高不断升高;30 ℃是生长和产酶的最佳温度，菌体生长迅速，生物量和产酶量达到最高。但温度升高到35 ℃时，菌开始停止生长。

2.4 培养基初始pH值对生长和产酶的影响

将培养基的初始pH调整为3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0，初始pH值对生长和产酶的影响见图2。

由图2可以看出：在pH 8.0的培养基中，菌体长最好，产酶量最高，其次为pH 7.0的培养基。由此确定培养基最适初始pH值为8.0。

2.5 培养时间对生长和产酶的影响

培养时间对生长和产酶的影响见图3。

在前6 h里，菌体处于延滞期;6～22 h，菌体生长迅速，表明菌体处在对数期，并在24 h时菌体浓度达最大值，OD600为1.004（稀释二倍）;此后，菌体生长变慢，处于稳定期;在26 h后菌体开始自溶，浓度不断下降。

从还原糖浓度变化来看：发酵液中的酶活力逐渐升高，在24 h达到最高;此后菌体量开始下降，酶活力在24～72 h之间呈稳定状态，72 h后呈现下降趋势。故24 h为最佳培养时间。

3 结论

以菌株AGN12为试验对象，以碳源、氮源、培养时间、培养基初始pH值、培养温度等为因素，研究褐藻酸降解菌的最佳生长及产酶条件。通过单因素试验确定AGN12菌生长及产酶的最佳条件为：以0.7%海藻酸钠为碳源，以0.3%硫酸铵为氮源，培养温度30 ℃，培养基初始pH值8.0，培养时间24 h。