基于时间、OD600值及平板计数法测定嗜酸乳杆菌数量的方法

刘霞 曾凤娇 于航 白国辉 田源

1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563000；3.遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563000

嗜酸乳杆菌（lactobacillus acidophilus，LA）属于乳杆菌属，是革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，乳白色菌落，边缘卷曲。显微镜下观察可见以单个、成双或者短链排列［1］。嗜酸乳杆菌为一种广泛存在于人及动物肠道内的益生菌，研究表明嗜酸乳杆菌在维持胃肠道的生理功能中发挥重要作用［2-4］。最新研究发现嗜酸乳杆菌与龋病密切相关，儿童牙菌斑中变形链球菌与嗜酸乳杆菌均可作为龋风险评估中危险因素的检测指标［5］；对龋病微生物的相关研究表明，微生物的群落组成变化会影响龋病的临床进展状态，嗜酸乳杆菌和戈登链球菌的阳性检测结果与活跃性龋明显相关［6］。

细菌浓度测定方法有很多，如平板菌落计数法、显微镜计数法、比浊法、分光光度法［7］等，单独使用一种方法来测定细菌菌液浓度有其各自的优点和缺点。本研究试图通过两种方法相结合的方式来寻找一种更加简便有效的菌液浓度测定方法。OD600是指某种溶液在600nm波长处的吸光值，一定浓度范围内，菌液中细菌浓度与其液体光密度（OD值）成正比，因此可以利用紫外分光光度计测定菌液的OD值来推测菌液浓度［8］。平板计数法是将检测样品稀释至相应倍数的液体，再取一定量样品培养至相应固体琼脂板，形成肉眼可见的单菌落，再根据稀释倍数和取样量计算原样品浓度。本实验将OD600与平板计数法与时间相结合，希望找到一个更加简便有效测定菌液浓度的方法，为实验提供帮助。

1 实验材料

1.1 菌株、试剂及仪器 嗜酸乳杆菌（贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存）；MRS肉汤（品牌：Solarbio货号：M8540），琼脂粉（索来宝，北京）；紫外分光光度计（Backman，德国）、厌氧培养箱（型号：BACTRON EZ-2，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌的培养与鉴定。①培养基配置：MRS固体培养基：称取MRS肉汤4.8g，琼脂粉2.8g，溶解于100mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至60℃左右倒入无菌培养皿，置4℃冰箱备用。MRS液体培养基：称取MRS肉汤4.8g溶解于100mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min备用；②菌种复苏及培养：将甘油保种的嗜酸乳杆菌解冻后，超净台内用无菌接种环取适量菌液采用连续划线法接种于MRS固体培养皿上，37℃厌氧箱（80%N2，10%H2，10%CO2）内培养 24h；③菌种鉴定：培养箱中取出培养皿，超净台内用接种环在直径为1mm的菌落上取适量细菌涂布于载玻片上，进行革兰染色（初染→媒染→脱色→复染），显微镜下进行形态学鉴定；④菌种扩大培养：超净台内取MRS液体培养基于15mL离心管内，无菌接种环挑取鉴定完成后的菌落扩大培养于离心管中，37℃厌氧箱培养。

1.2.2 嗜酸乳杆菌菌液浓度的测定。①紫外分光光度计测定菌液OD600值：挑取鉴定成功的嗜酸乳杆菌单菌落于装有MRS液体培养基的离心管中，37℃厌氧箱培养20h，将菌液颠倒均匀后取适量菌液，紫外分光光度计600nm波长，以MRS液体培养基作为参照测定一个初始OD600值后继续培养，再分别于2h、4h、6h、8h（总时长分别为 22h，24h，26h，28h），测定其 OD600值；②平板菌落计数：每个时间点测定OD600值后，超净台内准备9只15mL离心管，编号，每管内加入0.9mLMRS液体培养基，取0.1mL初始菌液到1号离心管中，依次类推以10为梯度从102～1010进行菌液稀释，将稀释后的菌液每管取0.1mL涂布于MRS固体培养皿，37℃厌氧箱培养24h后进行菌落计数，可推算出菌液浓度=（菌落数×稀释度/0.1CFU/mL）。

2 结果

2.1 嗜酸乳杆菌的培养及鉴定结果 培养皿中嗜酸乳杆菌生长良好，肉眼观为乳白色、凸起、边缘卷曲的菌落；革兰染色后显微镜下观察细菌被染为紫色，呈杆状，以单个，成双或者短链排列，为革兰阳性杆菌，证明该细菌为嗜酸乳杆菌。见图1。

图1 嗜酸乳杆菌培养及革兰染色

2.2 各时间段OD600与平板菌落计数结果 分光光度计测定液体培养基厌氧培养20h时OD值为0.784，22h、24h、26h、28hOD 值分别为 1.019、1.094、1.329、1.389，平板菌落计数见图2。不同时间点OD值、菌液稀释度及菌落数结果见表1。结果表明，在稀释倍数为102～105时，平板菌落数均大于200个，可忽略不计；当厌氧培养22h，OD值达1.0时，稀释107倍后菌落计数为3，可计算出原菌液浓度为3×107/0.1=3×108CFU/mL，将菌液与培养基取等体积稀释后浓度为1.5×108CFU/mL，即得到0.5号麦氏浊度标准管的细菌浓度。

图2 平板菌落计数图

表1 随时间变化不同稀释度的菌落平板计数（CFU）

3 讨论

抑菌试验是指在体外测定样品的抑菌或杀菌能力，常用的方法包括纸片法和最小抑菌浓度法［9］。纸片法又叫抑菌圈法，是将待测药物滴在纸片上置于含有一定浓度菌液的琼脂平板中扩散，从而使其周围的细菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈的大小来判定药物的抑菌效果。最小抑菌浓度法是将一定浓度的抗菌药物稀释至不同浓度后接种受试菌株，通过测定菌株在不同浓度药物培养基内的生长情况定量检测该药物的最低抗菌浓度。而不管使用哪种方法，都需要将菌液调整到一个适宜的浓度。

细菌浓度测定方法有很多，平板菌落计数法操作复杂，所需时间长，显微镜计数法需要相应仪器；比浊法虽然简单，但容易受外界环境或者培养基颜色影响，准确性欠佳；分光光度法则需要制作标准曲线［10］。每一种测定方法都有其相应的缺点和优点。所以，将平板菌落计数法和分光光度法结合起来，观察菌液随着培养时间的变化。经过实验发现，嗜酸乳杆菌厌氧培养22h，OD600值达到1.0时，稀释107倍后菌落计数为3，可推算出原菌液浓度将菌液与培养基取等体积稀释后，即得到0.5号麦氏浊度标准管的细菌浓度。这种方法简便、高效、准确性较单纯比浊法好，且不需要借助特殊仪器，能够为我们的基础实验提供帮助。