一株降解页岩气采出水耐盐菌的分离鉴定与特性

金 艳， 张永红， 宋兴福， 连 伟， 何 化， 于建国

（1. 华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237；2. 中国石油工程建设有限公司西南分公司，成都 610041）

一般将含有大量有机物同时总溶解固体（TDS）在10～150 g/L 的废水称为高盐有机物废水[1]，如农药、制药、制革、石油、石化和纺织等行业排放的一些生产废水，均具有此特征[2-4]。废水中的高盐度不仅会抑制微生物的代谢功能，还会影响处理效果，因此很多研究人员通过分离和富集得到耐盐菌去处理各种含盐废水[5-8]。页岩气采出水也属于难处理的高盐有机废水，其主要来源于页岩气压裂过程中的大量返排液[9]，其中不仅含有原压裂液的化学物质，而且由于长时间接触地层岩石而混入大量悬浮物、油脂、天然放射性物质、重金属、酚类、酮类等多种污染物[10-12]。由于页岩气采出水中各种污染物成分复杂，且含盐量高，如不进行合理的无害化处理，会对周围环境造成很大危害。生化法较之物理法和化学法有着经济、高效的优点[13]，如果能筛选出降解页岩气采出水的高效耐盐菌，对经济有效地处理页岩气采出水具有重要作用。

嗜盐微生物是一类新型的且应用前景广阔的微生物资源，其结构组成、生理特性和代谢途径极为特殊，一般情况下高盐浓度会引起质壁分离和细胞活性丧失，但嗜盐细菌在高盐环境下却能正常生存生长，一些极端耐盐菌甚至在非高盐条件下无法存活[14-15]。耐盐微生物的投加能够改善盐度对微生物活性的抑制作用，大幅提高有机物的降解效果，在高盐废水处理工艺中具有巨大的应用潜力[16-17]。本文筛选、分离出一株对页岩气采出水具有一定降解能力的耐盐菌，并对此菌株进行一系列的生理生化鉴定及生长特性研究。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 培养基 七水硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸二氢钠(NaH2PO4)、氯化铵（NH4Cl）、氯化钠 (NaCl)、六水氯化镁 (MgCl2·6H2O)、氯化钾 (KCl)，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水葡萄糖（Anhydrous glucose）：分析纯，上海天莲化工科技有限公司；酵母膏（Yeast）：分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂（Agar）：分析纯，广东环凯微生物科技有限公司。1.1.2 实验仪器 采用扫描电子显微镜SEM（ZEISS EVO18，德国卡尔蔡司光学有限公司）对菌株形貌进行分析。采用总有机碳TOC 分析仪（elementar vario TOC，德国elementar 公司）分析处理前后废水中有机物浓度。分光光度计（MAPADA UV-6100s，中国美谱达仪器有限公司）。采用恒温振荡培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、离心机等进行菌的分离与纯化。

1.2 实验方法及分析方法

1.2.1 培养基配制 耐盐培养基：FeSO4·7H2O 0.05 g/L；NaH2PO40.45 g/L； NH4Cl 0.3 g/L； NaCl 40 g/L；MgCl2·6H2O 0.5 g/L；KCl 0.3 g/L；无水葡萄糖 1 g/L；酵母膏 0.2 g/L；其余为去离子水，pH 6.5～7.0。

固 体 培 养 基 ： FeSO4·7H2O 0.05 g/L； NaH2PO40.45 g/L； NH4Cl 0.3 g/L； NaCl 40 g/L； MgCl2·6H2O 0.5 g/L；KCl 0.3 g/L；无水葡萄糖 1 g/L；酵母膏 0.2 g/L；琼脂20 g/L；其余为去离子水，pH 6.5～7.0。

废水培养基：废水中添加氮、磷，氮源是尿素，磷源为K2HPO4，投加量为m（C）∶m（N）∶m（P）=100∶5∶1。

1.2.2 耐盐菌筛选与分离

（1）耐盐菌群初筛

初筛菌株主要来源于污泥样品和废水样品，污泥样品包括海泥、气田采出水排放口污泥和碱减量高盐废水池底泥等，废水样品包括页岩气返排液、气田水、煤化工高盐废水、精细化工高盐废水等。

分别取10 g 污泥样品或10 mL 高盐废水样品于含有100 mL耐盐菌培养基的灭菌三角瓶中，30 ℃下振荡进行富集培养，5～7 d 后再取10 mL 加入100 mL耐盐菌培养基中继续富集培养，反复4～5 个周期后，获得耐盐菌群。

（2）耐盐菌纯化分离

制作固体平板培养基，用接种环采用涂布划线接种法将富集液接种至已灭菌的平板培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养3～4 d，当培养基中长出菌落后，挑取不同菌落分别进行单菌落的反复划线及培养，直到形成单一菌落。

（3）高效降解耐盐菌筛选

将分离出来的纯菌液，定量投加至待降解废水中，然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中，180 r/min振荡，培养24 h 后进行离心处理，然后取上清液测定化学需氧量（COD）。

1.2.3 耐盐菌形态观察 采用电镜对筛选出的菌株进行形态观察。将菌液先进行预处理，然后进行喷金处理，再进行电镜扫描。

电镜前预处理方法：取筛选出的培养菌液1 mL置于1.5 mL 的离心管中，以10 000 r/min 转速离心3 min，弃上清液，加 900 μL 双蒸水（ddH2O）和 100 μL 甲醛，充分打散，静置25 min，以10 000 r/min 转速离心3 min，弃上清液，再依次用体积分数为30%、50%、70%、100%乙醇进行充分打散和离心去除上清液。

1.2.4 耐盐菌生长特性研究 取培养24 h 后的处于稳定期的菌液，定量接种于高温灭菌后的不同NaCl 盐浓度嗜盐培养基中，然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中，180 r/min 振荡，培养一定时间后，取样，用分光光度计于600 nm 波长处测光密度值，即OD600。OD600是溶液在600 nm 波长处的吸光度值，利用细菌的吸光度来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，细菌生长比较好的时期一般是在 OD600为 1 时。

1.2.5 耐盐菌总有机碳（TOC）降解研究 取培养24 h后的处于稳定期的菌液，分别定量接种于待降解的废水中，然后置于30 ℃的恒温振荡培养箱中，180 r/min振荡，培养24 h 后测量其TOC。

TOC 测试预处理：取样品于12 000 r/min 转速下超速离心5 min 后加入TOC 测量管中。用10 mL去离子水加入TOC 测量管中作为清洗液。选用总有机碳-总碳（TIC-TC）模式进行自动测量和分析。

1.2.6 分析方法 TOC 含量采用TOC 测定仪；氨氮含量采用纳氏试剂分光光度法；溶解固体总量（TDS）含量采用重量法；氯离子浓度采用滴定法。

1.3 废水水质

页岩气采出水取自四川省宜宾市H24#矿区，其水质分析如表1 所示。本废水特点为有机物含量高，盐含量高，属于NaCl 体系。

表 1 废水水质分析Table 1 Analysis of wastewater

2 结果与讨论

2.1 优势单菌的分离与筛选

采集气田采出水、页岩气返排液、煤化工高盐废水、精细化工中高盐废水等高盐废水水样和周边土样若干，通过富集、筛选、纯化，分离出47 株可在质量分数为8%NaCl 体系中生长良好的耐盐菌。将这些菌株分别投加到页岩气压裂返排液中，进行降解实验，其结果如图1 所示。

图 1 不同耐盐菌的TOC 去除率Fig. 1 TOC removal rate of different salt-tolerant bacteria

由图1 可知，菌株编号为CF3P、206BP、206BW、206B-H-W、206F-H-G、202B-H-W、CNM 和 CFP 菌株的TOC 去除率均能达到50%以上，其中206BP 的降解效果最好，因此选取206BP 菌株作为降解页岩气采出水的优势菌株，并对其生理化学特性进行分析。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌落形态 将编号为206BP 的菌株接种至选择性固体培养基平板上，观察菌落形态，如图2 所示。在平板上培养3 d 后，206BP 菌株的单菌落形状呈圆形，菌落光滑，颜色为不透明淡粉色，直径约为2～3 mm。接种后的液体培养基在摇床中培养1 d 后的菌液呈浑浊淡粉色，延长培养时间颜色无明显变化。

2.2.2 菌株形态 采用SEM 观察得到的菌株206BP

形态如图3 所示，菌株细胞呈椭圆形，表面有不规整的凹凸状，直径大小约为2.0 μm，产生的芽孢直径大小约为 0.3～0.6 μm。

图 2 菌株206BP 的菌落形态和液体培养基外观Fig. 2 Characteristics of 206BP bacterial colony and appearance of liquid medium

图 3 菌株206BP 电镜扫描图Fig. 3 SEM of strain 206BP

2.2.3 菌株生化特性 实验中对菌株206BP 进行生理生化实验，结果见表2。

表 2 菌株206BP 生理特征Table 2 Physiological properties of strain 206BP

实验结果表明，该菌株为革兰氏染色阳性菌，可产生分解尿素的尿素酶和硫化氢气体，能够水解利用淀粉，不能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，不能液化明胶，可还原硝酸盐。

2.2.4 16S rDNA 碱基序列与系统发育树 DNA 提取结果见图4，实验中菌株总DNA 的条带整齐明亮，无降解现象。聚合酶链式反应（PCR）后，在1 000 bp 左右处有明显的产物条带，条带整齐明亮。

图 4 菌株 206BP 的 (a)DNA 条带和 (b)PCR 产物条带Fig. 4 (a) DNA and (b) PCR result of strain 206BP

PCR 结果分析：通过 PCR 扩增得到 1 000 bp 左右条带，序列为：5’—CTCTGTCACCTCATGCG GCTGGCTTCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGG TGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTG TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGC ATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTT CATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAAC TGAGAACGGTTTTATGGGATTGGCTAAACCTC GCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCGTCCATTGTA GCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT TGTCACCGGCAGTCATCTTAGAGTGCCCAACT GAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCT CGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACA CGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC TCTGTCCCCCGAAGGGGAAAGCCCTATCTCTA GGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGG TTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT GAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGC GGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAA GGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATC GTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATC CTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGT CAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACT GGTGTTCCTCCAAATATCTACGCATTTCACCGC TACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACT CAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGT TGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAA ACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTC CGGACACGCTGCCACCTACGTATTACCGCGGC TGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTT AGGTACCGTCAAGGCGCCGCCCTATTC—3’。对该基因进行局部相似性基本查询工具（BLAST）中的Blastx 程序分析，发现GenBank 中该基因与其菌株的16S 氨基酸序列相似性较高。

选取与之相近的其他21 种菌株通过clustalw2.0建立系统发育树，结果见图5。系统发育分析表明16S rDNA 与Bacillus purgationiresistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性，相似性达到99%，该菌属于芽孢杆菌属。

图 5 菌株 206BP 的 16S rDNA 系统发育树Fig. 5 16S rDNA phylogenetic tree of strain 206BP

2.3 菌株的生长特性

2.3.1 菌株206BP 的生长曲线 将菌株206BP 扩增繁殖后，按1∶100 的体积比接种于含NaCl 质量分数为4%的培养基中，在30 ℃、180 r/min 条件下振荡培养，间隔1～4 h 取样，用分光光度计在波长600 nm 处检测菌悬液的吸光度，绘制菌株生长曲线，见图6。

图 6 菌株206BP 生长曲线Fig. 6 Growth curve of strain 206BP

由图6 可知，在NaCl 质量分数为4%的培养基中，菌株 206BP 在 0～5 h 处于生长延滞期，5～22 h 处于指数生长期，24 h 之后达到稳定期，稳定期时间较长。

2.3.2 盐度对菌株生长影响 嗜盐菌根据其对盐的依赖程度分为嗜盐菌及耐盐菌，而根据具体耐盐程度不同又分为轻度耐盐菌、中度耐盐菌以及极端耐盐菌，中度耐盐菌在NaCl 质量分数为3%～15% 范围内可很好地生长[18]，极端耐盐菌可在NaCl 质量分数为15%～30% 范围内生长[19]。菌株在最佳耐盐条件下可以生长良好，并且进行正常繁殖，但是在非适宜条件下，就会影响其正常的生长及繁殖。实验中配制液体培养基NaCl 质量分数分别为0、1%、2%、3%、 4%、 5%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、 16%、18%、20%，菌株206BP 在不同NaCl 质量分数下的生长曲线见图7。

由图7 可知，在NaCl 质量分数为0～20%条件下，菌株206BP 的生长情况差异明显，当NaCl 质量分数在 0～1%、5%～20%两个区间时，菌株在培养14～16 h 后才进入指数生长期，当NaCl 质量分数为8%时，直至19 h时进入指数生长期，值得注意的是，当NaCl 质量分数大于10%时，菌株206BP 的生长始终处于停滞期，生长缓慢甚至几乎不生长，而当NaCl 质量分数为2%～4%时，菌株206BP 在培养12 h后即进入指数生长期，这与中度耐盐菌特性吻合，菌株206BP 属于中度耐盐菌。

图 7 NaCl 不同质量分数下菌株206BP 的生长曲线Fig. 7 Growth curve of strain 206BP in different w(NaCl)

2.3.3 碳源及其浓度对菌株生长影响 实验中选取葡萄糖、草酸、可溶性淀粉、蔗糖、抗坏血酸、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖为菌株206BP 的唯一碳源来确定菌株对不同碳源的转化利用情况，结果见图8。

图 8 碳源对菌株206BP 生长的影响Fig. 8 Effects of carbon sources on growth of strain 206BP

由图8 可知，菌株206BP 对草酸的利用效果最差，在以草酸为唯一碳源时，菌株几乎不生长，在接种培养24 h 后，OD600只有0.028；菌株对抗坏血酸、可溶性淀粉和半乳糖的利用效果也不理想，在接种培养 24 h 后，OD600分别为 0.106、0.198、0.484；以葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖和木糖为唯一碳源时菌株生长良好，接种培养 24 h 后，OD600分别为 1.045、0.965、1.086、1.042 和 0.889，其中果糖的 OD600比葡萄糖的OD600略高，考虑到葡萄糖的成本比果糖低，选择葡萄糖为206BP 菌株培养基的最佳碳源。

本文测定了不同葡萄糖质量浓度（0、200、500、1 000、2 000、5 000 mg/L）对菌株生长的影响，结果见图9。在不同质量浓度葡萄糖条件下，生长曲线中稳定期的OD600值随着葡萄糖质量浓度的上升而上升，碳源作为微生物的大量营养物,其质量浓度影响了菌株的生长总量。当葡萄糖质量浓度为0～2 000 mg/L时，生长曲线的停滞期时间基本相同，当葡萄糖质量浓度达到5 000 mg/L 时，停滞期延长，进入指数期的时间较其他质量浓度条件推迟约5 h，表明碳源质量浓度过高也会对菌株生长产生一定的抑制作用。

图 9 葡萄糖质量浓度对菌株206BP 生长的影响Fig. 9 Effects of glucose mass concentration on growth of strain 206BP

2.3.4 氮源及其浓度对菌株生长的影响 实验中选择 NaNO3、NH4Cl、CH3CO2NH4、(NH4)2SO4和尿素为氮源进行最佳氮源实验，结果见图10。

图 10 不同氮源对菌株206BP 生长的影响Fig. 10 Effects of nitrogen sources on growth of strain 206BP

由图10 可知，菌株206BP 对醋酸铵的利用效果最好，对NaNO3的利用效果最差。在以醋酸铵为氮源时，生长曲线稳定期的OD600值明显更大，表明醋酸铵有助于菌株生长总量的增加，这主要是因为醋酸铵内含有一定比例的碳源。由于菌株对尿素、NH4Cl 和(NH4)2SO4利用效率差不多，从经济成本考虑，选择尿素为最佳氮源，并考察不同氨氮质量浓度对菌株生长的影响，实验结果见图11。

由图11 可知，不同尿素质量浓度对菌株生长曲线的停滞期没有影响，不同尿素质量浓度时停滞期均为5 h 左右，对指数期的生长速率略有影响，质量浓度高时生长速率大，对菌株生长总量也有一定影响，尿素不添加时，稳定期OD600低于含氮源条件下的值，菌株接种后培养到32 h 时，尿素质量浓度为0、10、50、100、200、300、600、1 200 mg/L 时对应的OD600分 别 为 0.739、 0.843、 0.873、 0.878、 0.861、0.864、0.865 和0.861，结果表明，当质量浓度增加到50 mg/L 时，继续增加尿素质量浓度对菌株生长已经没有进一步的促进作用，因此选择尿素最佳质量浓度为50 mg/L。

图 11 尿素质量浓度对菌株206BP 生长的影响Fig. 11 Effects of urea mass concentration on growth of strain 206BP

2.3.5 初始pH 对菌株生长的影响 pH 是影响微生物生长的主要因素之一，实验中考察不同pH 值对菌株206BP 的生长影响，结果见图12。由图可见，菌株可生长的pH 值在5～8 之间，当pH 值为5 时，菌体进入指数期的时间会延后，但是一旦适应后，稳定期的OD600值比 pH 值为 7 时还要高 0.1，因此最佳 pH 值为5～7。

图 12 pH 值对菌株206BP 生长的影响Fig. 12 Effects of pH value on growth of strain 206BP

3 结 论

（1）以不同高盐废水和土壤样品为菌源，从中分离纯化出多株可耐高盐菌，并筛选出对页岩气采出水中有机物具有最佳降解效果的优势菌株，该菌株大小约 2 μm，芽孢约 0.3～0.6 μm，菌株为革兰氏染色阳性菌，菌株生长过程中产生分解尿素的尿素酶和硫化氢气体，对淀粉能够水解利用，不能分解蛋白质中色氨酸生成吲哚，不能液化明胶，可还原硝酸盐和亚硝酸盐。

（2）通过16S rDNA 基因分析和构建系统发育树可知，菌株206BP 的16S rDNA 与Bacillus purgationir--esistens 等菌株直系同源物具有最高的相似性，属于芽孢杆菌的一种，但是未找到一致序列，推断为芽孢杆菌新型菌株。

（3）不同因素对优势菌株生长影响实验结果表明，该菌株在NaCl 质量分数为0～8%下生长良好，属于中度耐盐菌；菌株生长的最佳pH 在5～7，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为尿素。