DNA 甲基化与COPD 关系的研究进展

祁亚楠，尚茜，齐咏,★

（1.郑州大学人民医院呼吸与危重症医学科，河南 郑州；2.河南省人民呼吸与危重症医学科，河南 郑州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一个日益严重的全球性健康问题，直接影响着3亿多人，是世界上第三大死亡原因[1]。同时，由于缺乏有效的治疗策略，导致医疗成本巨大，成为主要的公共卫生负担[2]。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，随着全基因测序技术的发展和甲基化芯片技术的出现，大量研究发现DNA甲基化与COPD相关[3]。在不影响DNA序列的情况下，遗传和环境因素均可通过调控基因的DNA甲基化来影响DNA片段的活性，从而调控基因表达，参与COPD的病理生理过程。

1 DNA 甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，将一个甲基基团加到胞嘧啶残基的5’端，可逆地修饰DNA结构而不改变DNA序列，通过影响DNA片段的活性调控基因表达的过程。DNA序列中富含GC的CpG二核苷酸簇被称为CpG岛，通常基因启动子区域中CpG岛的DNA甲基化会导致基因沉默，而甲基化不足会触发转录激活调控基因表达。与基因启动子区域相反，基因体中的DNA甲基化常与DNA转录增强相关[4]。

2 COPD 与 DNA 甲基化

COPD是一种进行性肺部疾病，与年龄和吸烟有关，由于慢性支气管炎和肺气肿导致不可逆转的气流受限。其特征在于不可逆的气流受限，通常是渐进性的，并伴随着呼吸道和肺部对有害颗粒或气体（特别是香烟烟雾）的慢性炎症反应[5]。COPD的发病机制包括弹性蛋白酶-抗弹性蛋白酶假说、慢性炎症、氧化剂-抗氧化剂的失衡、细胞凋亡和无效修复等，吸烟是其主要环境危险因素。DNA甲基化是连接环境与遗传基础的桥梁，穿插在COPD的各个发病机制之中介导基因表达[6]。已有较多证据表明COPD的存在和严重程度与DNA甲基化的异常表达有关[7-11]，DNA甲基化可能是COPD特异性基因表达改变的基础，对 DNA 甲基化的深入研究为COPD开发新的表观遗传治疗干预措施提供机会。

2.1 肺功能与异常的DNA 甲基化

COPD 是一种气道疾病，肺功能降低是其诊断的必备条件，肺功能检查有助于 COPD 的诊断和病情评估。研究发现芳基烃受体阻遏基因(AHRR)cg05575921位点低甲基化与吸烟、肺功能低下、肺功能急剧下降和呼吸系统症状相关[12]。Kodal等人[13]对1991-1994年哥本哈根城市心脏队列研究的9113个个体行外周血AHRR甲基化测定及肺功能检查，于2001-2003年对其中4532个个体再次行外周血AHRR甲基化测定及肺功能检查，横断面研究结果表明AHRR低甲基化与FVC、FEV1/FVC有关，前瞻性分析发现AHRR甲基化程度与FEV1/身高和FVC/身高有关，与FEV1/FVC(p=0.08)无关。IL6、IFNγ 具有促炎和抗炎的双重作用，可能通过激活负反馈发挥作用，其基因的低甲基化与FEV1升高相关[14]。

在两个关于COPD的研究队列中，Qiu等人[15]通过Illumina27K阵列观察到349个CpG位点的甲基化与COPD的存在和严重程度（是否存在 COPD、FEV1/FVC、FEV1）相关。349个CpG位点的基因（330个基因）分析表明，许多基因参与了免疫和炎症反应、对压力的反应、以及伤口愈合和凝血级联反应等。其中与FEV1/FVC关联最高的五位是SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、TRPM2和LRP3基因的CpG位点，与FEV1关联最高的五位是 SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、FUT7和 STAT5A基因的CpG位点，其中SERPINA1基因的2个CpG位点cg02181506和cg24621042与 COPD、FEV1/FVC、FEV1均显著相关。

与Qiu等人的研究不同，De Vries等人发现36个CpG位点甲基化水平与FEV1/FVC相关[16]，但与COPD的存在与否无关[17]，这两项研究的结果不同，可能是因为这两项研究均为非随机横断面研究且纳入标准不同，同时表明DNA甲基化研究是高度可变的。Bermingham等人[18]通过Illumina 850K阵列进一步确认了28个与是否存在COPD和呼吸功能特征（FEV1、FVC和FEV1/FVC）相关的差异甲基化修饰位点（DMS）,这些DMS位点被定位到参与选择性剪接、JAK-STAT信号通路和轴突相关的基因上，具体作用机制尚不清楚。DNA甲基化未来有可能成为评估COPD存在、严重程度、肺功能及预后的生物标志物，为COPD的诊断及病情评估提供新的方法。

2.2 COPD 的发病机制与异常的DNA 甲基化

2.2.1 细胞凋亡

Notch1能通过抑制细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路来减轻COPD患者香烟烟雾诱导的内皮细胞凋亡[19]，ERK通路通过调控线粒体转录因子A (mtTFA)启动子的甲基化参与COPD的发生发展[20]。Qiu等人[21]通过对人支气管上皮细胞和鼠肺泡巨噬细胞系的研究发现由Notch信号激活介导的Klotho甲基化可以通过增加炎症反应和细胞凋亡来参与COPD的发病机制，因此未来Notch可作为COPD、抗衰老因子和抑癌剂的药物作用靶点。

COPD患者肺泡巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力下降，并且该缺陷可能与鞘氨醇-1磷酸酯系统有关，特别是鞘氨醇-1-磷酸受体5（sphingosine-1-phosphate receptor 5，S1PR5）。为进一步研究COPD与S1PR5的关系，Barnawi等人[22]从COPD患者中分离出肺泡巨噬细胞，发现COPD患者肺泡巨噬细胞S1PR5启动子甲基化水平低于健康非吸烟者，与S1PR5的表达呈负相关。而体外培养的巨噬细胞经甲基化抑制剂处理后吞噬能力增强，且增强程度与抑制剂剂量呈正相关。

2.2.2 氧化应激

既往研究表明DNA甲基化与香烟烟雾/氧化剂介导的肺部疾病有关[23]，氧化应激是吸烟诱导 C0PD 发病的重要机制之一。COPD的发生与肺中的主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)在气道上皮细胞中的合成速率直接相关，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）是GSH合成的限速酶的调节亚基，GCLC启动子的高甲基化与COPD的发生发展相关。CHENG等人[24]发现与肺功能正常的前吸烟者和从不吸烟者组相比，当前吸烟者和COPD患者肺组织中GCLC启动子的高甲基化，降低了GCLC mRNA的表达、血浆GSH水平。烟草提取物(cigarette smoke extract，CSE)诱导的人支气管上皮细胞经5-氮杂-2’-脱氧胞苷（AZA；脱甲基试剂）处理后GCLC的表达增高。Peng等人[19]在COPD患者肺组织、CSE处理的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中发现mtTFA启动子高甲基化、mtTFA mRNA和蛋白表达下降，而AZA可恢复CSE引起的HUVECs中mtTFA的表达。表明吸烟诱导的相关基因启动子高甲基化可能与COPD的发生发展相关，未来可能通过开发去甲基化药物为COPD的干预提供新的策略。

Vucic等人[25]对COPD患者及对照组的小气道上皮的DNA和RNA进行了全基因组甲基化和基因表达检测，通过富集分析，发现COPD患者DNA甲基化和基因表达水平显著差异的3条通路：磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）信号传导通路、NF-E2相关因子2（Nrf2）信号通路以及IL-17炎症反应通路，其中Nrf2信号传导通路最显著，有46个基因的甲基化差异表达。COPD患者PTEN通路中的PTEN和CSNK2A2基因高度甲基化、表达不足；Nrf2通路是抵抗氧化应激的主要细胞防御系统，该通路中的两个基因EPHX1和CYP4F11是整体甲基化和表达改变最负相关的基因，COPD 患者 EPHX1 和 CYP4F11的表达降低；IL-17的过表达与许多炎症性疾病有关，但其在COPD中的作用尚不明确，COPD患者该途径中的上游受体IL17RC和下游受体CXCL1高甲基化且表达不足，促炎性CSF2基因低甲基化、过表达。

2.2.3 肺气肿

DNA甲基化参与肺气肿的病理生理过程。Yoo等人[26]确定了126个COPD的调节因子，其中EPAS1是唯一的关键调控因子,EPAS1是一种低氧反应性转录因子，也称为低氧诱导因子2α，其下游基因与COPD疾病严重程度相关的多个基因组明显重叠，包括缺氧应答基因和与肺气肿严重程度相关的基因。与对照组相比，COPD患者肺组织中的EPAS1甲基化水平与疾病严重程度显著相关，且 EPAS1蛋白表达降低。

干细胞抗原1（Sca-1）是一种小鼠糖基磷脂酰肌醇固定蛋白，是造血干细胞的细胞表面标记，也可以由非造血器官中的组织驻留干细胞和祖细胞表达，内皮祖细胞是造血干细胞的一种亚型，通过归巢在损伤部位促进内皮修复。He等人[27]研究的结果表明，祖细胞池的消耗和Sca-1基因的甲基化可能与小鼠肺气肿的发生发展有关,通过DNA甲基化抑制剂地西他滨可以抑制Sca-1基因的甲基化，增强肺组织和骨髓来源的内皮祖细胞中Sca-1的表达,部分保护小鼠免受CSE诱导的肺气肿。另一项关于抗凋亡Bcl-2的实验[28]支持DNA甲基化参与肺气肿的发生，该实验通过腹膜内注射CSE建立小鼠的肺气肿模型，发现CSE注射组肺细胞凋亡指数显著高于对照组（（25.88±7.55）%VS（6.28±2.96）%）。与对照组小鼠相比，在CSE注射小鼠中观察到Bcl-2启动子高甲基化、Bcl-2表达降低，而通过AZA可使Bcl-2启动子去甲基化、Bcl-2表达增强，减轻了CSE引起的肺细胞凋亡和功能衰竭。这表明抗凋亡的Bcl-2启动子甲基化可能是CSE诱导的肺气肿细胞凋亡增加的原因。

2.2.4 粘液高分泌

黏液分泌过多会增加COPD患者的发病率和死亡率，与杯状细胞化生有关。杯状细胞化生是由一个庞大的基因网络决定的，是COPD的共同特征，转录因子SPDEF和FOXA2是杯状细胞化生的两个关键调控因子。Song等人[29]将COPD患者和对照组的气道上皮细胞诱导分化为杯状细胞，发现对照组气道上皮细胞在IL-13诱导的杯状细胞SPDEF启动子CpG 8位点高甲基化、SPDEF表达增加，FOXA2低甲基化（CpG 14、15）、FOXA2表达降低；与对照组相比，在不存在IL-13的情况下COPD患者上皮细胞SPDEF启动子CpG 6位点低甲基化、SPDEF表达增加，FOXA2低甲基化（CpG 10、11）而表达水平没有变化。因此SPDEF和FOXA2的异常DNA甲基化可能是COPD粘液高分泌的潜在因素之一，为表观遗传学抑制粘液高分泌开辟了新的途径。

2.3 COPD 表型与异常的DNA 甲基化

明确COPD表型的异质性对个体化医疗的发展具有重要意义，而相关基因的DNA甲基化表达对COPD的分型具有积极作用。Lee等人[30]采用全基因组分析比较了24例急性加重期COPD患者与12例非COPD对照者外周血单核细胞甲基化水平，发现PRKAG2基因相关CpG位点在COPD患者和正常受试者中具有不同的甲基化水平，ALOX5AP基因相关CpG位点甲基化水平与对类固醇激素治疗反应良好相关。PRKAG2是腺苷酸激活蛋白激酶的一个非催化亚基，腺苷酸激活蛋白激酶与COPD患者肌肉自噬增强有关[31]，ALOX5AP涉及白三烯的生物合成，是阻断白三烯生成的药物靶点，且ALOX5AP抑制剂已被应用于包括COPD在内的炎性疾病的治疗[32]。

Rosas-Alonso等人[33]通过甲基化特异性聚合酶链反应定量检测COPD患者颊上皮miR-7甲基水平，发现肺气肿表型COPD患者miR-7甲基化水平较高。未来有可能根据DNA甲基化标记，对COPD患者进行分型来指导COPD患者的治疗，如对类固醇激素治疗反应良好的COPD患者可认为是一个独特的亚型。

2.4 其他

吸烟是COPD与肺癌共同的主要危险因素，两种疾病之间存在密切的联系[34]。Tessema等人[35]通过Illumina 450K阵列对非小细胞肺癌患者肺组织进行了表观基因组关联研究，发现与COPD相关的CCDC37和MAP1B表达降低可能导致这些基因高甲基化进而导致肺癌。肿瘤组织CCDC37和MAP1B的甲基化水平高于无癌肺组织，其中患有COPD的癌组织甲基化水平最高，且甲基化水平与CCDC37和MAP1B的表达呈负相关。与健康吸烟者相比，COPD患者的痰中CCDC37甲基化更为普遍，表明CCDC37和MAP1B的甲基化水平未来有可能成为预测COPD、肺癌发生的可能性的生物标志物。

Wielscher等人[36]通过临床病例研究发现了COPD 患者cg05979020（HOXD10）、cg05964935（N/A）、cg05769349（TBX5）和cg10384245（ADCYAP1）高甲基化。Busch等人[37]发现与COPD相关性最高的五个位点甲基化百分比的平均差异为5.3%至9.6%，其中甲基化最高的差异位点是cg16361890，其定位于MAML1基因，其余4个位点的基因注释为RBFOX2、CD72、GRASP和SH3TC1，与肺和气道生理相关[37]。

不同细胞或不同部位的DNA甲基化水平不同。Amstrong等人[38]通过Illumina 850K阵列对上叶、下叶不同部位的肺泡巨噬细胞进行了全基因组DNA甲基化检测，在95个CpG位点上观察到显著的甲基化差异，这些基因包括CLIP4、HSH2D、NR4A1、SNX10和TYK2，是炎症、免疫相关生物学过程的参与者。CLIFFORD等人[39]分离出具有和不具有COPD的个体的气道和实质成纤维细胞，进行DNA 甲基化检测，仅在实质成纤维细胞中发现差异DNA甲基化与差异基因表达相关。此外研究发现与非西班牙裔白人相比，非西班牙裔黑人的DNA甲基化水平明显较低[40]，表明DNA甲基化因性别和种族/民族的不同而不同，DNA甲基化作为表观遗传标记时需要考虑地域、种族等这些变量。

3 存在的问题及展望

大量研究表明，DNA甲基化与COPD有关，但发表的数据缺乏一致性，可能与研究的异质性有关如种族、研究设计、实验室方法和统计分析等。此外，由于缺乏前瞻性研究数据，DNA甲基化是导致疾病的原因或疾病导致的结果有待商榷，需要进一步的前瞻性研究以固定时间间隔的进行DNA甲基化检测，以评估疾病发生和甲基化的时间序列。

DNA甲基化是一种重要的基因组表观修饰形式，在COPD发生发展的中起着关键作用。表观遗传药物治疗COPD的探索是一个巨大的研究领域，本领域的深入研究将进一步揭示COPD的病理生理，为COPD的诊断和治疗提供新的靶点。