纵条纹炭角菌子实体的急性毒性试验及改善睡眠作用研究

苟 欢 任柳怡 雷传文 王 莉 贺新生 李国友 袁小红

纵条纹炭角菌子实体的急性毒性试验及改善睡眠作用研究

苟 欢 任柳怡 雷传文 王 莉 贺新生 李国友 袁小红*

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

为确定纵条纹炭角菌子实体的安全性及对改善睡眠的效应，通过急性毒性试验评价子实体安全性，并确定最大给药量；通过小鼠戊巴比妥钠阈剂量（阈下剂量）催眠试验，探究纵条纹炭角菌子实体对小鼠睡眠的效应。急性毒性试验显示纵条纹炭角菌子实体的最大给药量为2 000 mg/kg，小鼠的生理状况没有明显改变且在组织病理学分析中不存在毒性表现；戊巴比妥钠诱导的睡眠实验显示该菌子实体在高剂量（2 000 mg/kg）时可以显著增加入睡小鼠数量，延长小鼠睡眠时间并减少小鼠睡眠潜伏期（<0.01）。表明其可以用于失眠症的治疗。

纵条纹炭角菌；急性毒性试验；改善睡眠；LD50；最大给药量

纵条纹炭角菌Pat., Paris1: 247(1887)，属于子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、炭角菌亚纲（Xylariomycetidae）、炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科（Xylariaceae）、炭角菌属（Hill ex Schrank）[1]。炭角菌属的一些真菌具有镇静、抗前列腺炎等多种生物活性[2]，已有很多关于其化合物的研究报道[3]。

本课题组已完成研制并优化纵条纹炭角菌子实体的规模化人工培养方法[4, 5]。经活性筛选发现，其子实体具有较强的抗菌[6]和抗肿瘤活性[7]，但缺乏安全性及药理学的研究。本试验研究其改善睡眠的作用，并通过急性毒性试验，对其安全性作出评价，为临床应用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级昆明系小白鼠，体重18～22 g，雌雄各半，购于四川简阳达硕动物科技有限公司，动物合格证号：SCXK（川）2008-0005。雌雄分笼饲养，实验室适应性饲养7天，发现所选小鼠健康状态均良好。将小鼠置于室温20～24 ℃，空气相对湿度约40%，通风、光照良好的环境中饲养，任其自由饮水进食。

纵条纹炭角菌子实体（XS），由西南科技大学微生物实验室提供，经自然风干并于50 ℃烘干后，粉碎过100目筛备用。戊巴比妥钠（Service，上海化学试剂公司）。

1.2 仪器与设备

BS223S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），1 mL注射器，小鼠笼，小烧杯，外科器械等。

1.3 方法

（1）纵条纹炭角菌子实体急性毒性试验。半数致死量（LD50）测定：首先探索纵条纹炭角菌子实体使实验动物从0%到100%的死亡剂量。选取体重18～22 g小鼠30只，随机分成5组，每组6只，雌雄各半。1～4组分别按500 mg/kg、1 000 mg/kg、1 500 mg/kg和2 000 mg/kg小鼠体重灌服纵条纹炭角菌子实体粉末悬浊液，第5组以等体积生理盐水灌服，作为对照。观察并记录给药后小鼠的反应，连续观察7天，记录各组小鼠的死亡情况，判定LD50。如若LD50无法测出，则测定药物的最大给药量[8]。

最大给药量测定：将40只小鼠，雌雄各半，分成2组。对其中一组的20只小鼠灌服纵条纹炭角菌子实体粉末悬浊液，以该悬浊液可供灌胃的最大药物浓度200 mg/mL为试验给药浓度，小鼠灌胃所能承受的最大体积10 mL/kg为试验给药体积，得出最大给药量为2 000 mg/kg；另一组作对照组。记录小鼠每天健康状况，并于灌胃后第1天、第7天和第14天记录小鼠体重。在第15天处死实验小鼠，解剖摘取重要组织器官（心脏、肺、肾、肝），将其样品固定在10％的福尔马林缓冲液里，包埋在石蜡中，切片（厚为5 μm），染色（苏木精、伊红），并在光学显微镜下检查[9]，观察重要器官是否显著改变。

（2）对戊巴比妥钠阈剂量小鼠催眠作用的影响。将40只小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半。纵条纹炭角菌子实体按高剂量组（2 000 mg/kg）、中剂量组（1 000 mg/kg）、低剂量组（500 mg/kg）进行灌胃。灌胃体积为10 mL/kg，对照组灌服等体积的生理盐水。给药30 min后，4组小鼠均腹腔注射35 mg/kg阈剂量戊巴比妥钠，记录入睡潜伏期（注射后到翻正反射消失的时间）和睡眠时间（翻正反射消失到恢复的时间）。

（3）对戊巴比妥钠阈下剂量小鼠催眠作用的影响。试验动物分组及给药方式同上，给药30 min后，4组小鼠均腹腔注射25 mg/kg阈下剂量戊巴比妥钠，小鼠翻正反射消失1 min以上即为睡眠，观察给药后30 min内小鼠出现睡眠的只数。

（4）统计分析。计量资料用`x±SD表示，组间差异性采用单因素方差分析和多重比较；计数资料采用2检验。<0.05表示差异具有显著意义。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验结果

（1）LD50测定结果。实验结果显示，给药后7天，所有组别的小鼠精神状态均良好，食欲、皮肤、呼吸、运动等无异常，也无死亡。由于最高组使用2 000 mg/kg的剂量，是小鼠所能灌服的最大剂量，不能再加大剂量，因此均无法测得药物的半数致死量（LD50）。

（2）最大给药量测定结果。密切观察给药14天内各组小鼠的状态，小鼠的外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便颜色、被毛、呼吸、鼻、眼、口腔均无异常，体重正常（表1）。其内脏组织病理学切片均无明显变异（图1）。由此，得到纵条纹炭角菌子实体最大给药量为2 000 mg/kg。

表1 灌服纵条纹炭角菌后的小鼠体重

图1 纵条纹炭角菌对小鼠各脏器的影响（HE×200）

表2 纵条纹炭角菌子实体对戊巴比妥钠阈剂量小鼠催眠作用的影响

注：*表示差异显著，**表示差异极显著；表3同。

表3 纵条纹炭角菌子实体对戊巴比妥钠阈下剂量小鼠催眠作用的影响

2.2 对戊巴比妥钠阈剂量小鼠的催眠作用

纵条纹炭角菌高、中、低剂量组与对照组均能显著延长小鼠的睡眠时间（<0.05，表2），剂量为2 000 mg/kg则能极显著地缩短小鼠睡眠的潜伏期（<0.01）。

2.3 对戊巴比妥钠阈下剂量小鼠的催眠作用

纵条纹炭角菌子实体高、中、低剂量组与对照组比较（表3），小鼠的入睡数量明显增加，表明三种剂量均具有提高小鼠睡眠率的作用；随着剂量的增加，小鼠的入睡数量也增加。经2检验，高剂量组与对照组之间有极显著差异（<0.01）。

3 讨 论

小鼠急性毒性试验是毒理学安全性评价的最基础工作[10]，可了解受试物对机体的毒性效应，为今后的相关研究提供理论基础。但研究发现中药制剂的毒性很小，多数情况下无法测出其LD50，因此需要测定其最大给药量[11]。

本研究结果表明，纵条纹炭角菌子实体的最大给药量为2 000 mg/kg，但在此给药剂量下，试验动物小鼠仍未表现出中毒特征与死亡，且体重变化、内脏组织病理学切片与对照组无显著差异，说明纵条纹炭角菌子实体对小鼠体重、脏器功能毒性较低或无毒，安全性高。

协同戊巴比妥钠催眠模型是经典的镇静催眠药效评价模型。采用戊巴比妥钠阈下剂量进行实验，还通过阈上戊巴比妥钠实验[12]，观察小鼠的翻正反射消失情况来检测入睡潜伏期和睡眠时间。结果表明，纵条纹炭角菌子实体具有协同戊巴比妥钠催眠的作用，高剂量组能显著增加小鼠入睡数量，提高入睡率，延长睡眠时间，缩短睡眠潜伏期（<0.01），证实该菌具有明显的改善睡眠活性。

综上可知，纵条纹炭角菌子实体安全性较高，在2 000 mg/kg的最大给药量下小鼠仍没有毒性表现，且具有明显的改善睡眠活性，表明其可能用于失眠症的治疗。这一结果可为纵条纹炭角菌改善睡眠及其他生物学活性、药理学作用研究提供基础资料。

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[3] Silva GH, Oliveira CM, Teles HL, et al. Sesquiterpenes from Xylaria sp., an endophytic fungus associated with Piper aduncum [J]. Phytochem Lett, 2010(3): 164-167.

[4] 冯望, 吴颖, 尤雅, 等. 纵条纹炭角菌培养条件的优化[J]. 广东农业科学, 2014(10): 90-93.

[5] 刘霞, 高聪, 钟雨婷, 等. 纵条纹炭角菌菌丝体液体培养条件的优化[J]. 中药材, 2014, 37(8): 1317-1321.

[6] 袁小红, 张春杰, 刘霞, 等. 6种高等真菌醇提物对植物病原菌的抗菌活性研究[J]. 安徽农业科学, 2013, 41(12): 5289-5290.

[7] 袁小红, 张春杰, 郑仁林, 等. 六种高等真菌醇提物的抗肿瘤活性筛选[J]. 西南科技大学学报, 2013, 28(3): 95-97.

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Acute toxicity tests offruiting body and its effect on improving sleep

Gou Huan Ren Liuyi Lei Chuanwen Wang Li He Xinsheng Li Guoyou Yuan Xiaohong*

（College of Life Science and Engineering, Southwest University Of Science And Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China）

To investigate the safety ofand its effect on mice sleep improvement. The safety of the fruiting body ofwas evaluated by acute toxicity tests, and the maximum dose ofwas determined. The mouse pentobarbital sodium threshold dose (threshold sub-dose) hypnosis test was used to evaluate the effect of sleep in mice. Results: The acute toxicity test of fruiting body ofshowed that the maximum dose a mouse can take exceeds 2 000 mg/kg. The physiological condition of the mice did not change significantly and there were no toxic symptoms in histopathological analysis. Pentobarbital-induced sleep experiments showed that the fruiting body ofincreased significantly the number of mice, prolonged the sleep time of mice and reduced the sleep latency of mice (<0.01) in high dose of 2 000 mg/kg. Conclusion: Under the maximum dose of 2 000 mg/kg, mice showed no signs of toxicity, so the fruiting body ofis highly safefor oral administration. And it has the obvious improvement sleep activity, indicating its possible therapeutic use for insomnia.

; acute toxicity test; sleep improvement; LD50; the maximum dose

S646

B

2095-0934（2020）06-450-04

国家自然科学基金项目（21272189）；四川省大学生创新创业训练计划资助项目（201810619088）；中国国家转基因重大专项（2019ZX08010-004）

苟欢，四川南充人，研究方向为天然产物化学。E-mail：1203522826@qq.com。

袁小红，博士，教授，研究方向为天然药物和保健食品。E-mail：419225263@qq.com。