表型组学在水稻研究中的应用

彭永彬 谢先芝

(山东省水稻研究所, 济南 250100; *通信联系人, E-mail: xzhxie2010@163.com)

水稻是世界主要粮食作物。面对全球环境多变和人口快速增长所带来的一系列挑战，如何在减少投入的前提下有效挖掘水稻高产优质的潜力，是亟待解决的问题[1]。因此，培育具有病虫害抗性、养分利用率高、耐旱等特性的水稻成为解决问题的关键[2]。此外，水稻的基因组小，与其他禾本科作物的基因组具有共线性，因此水稻作为理想的单子叶模式作物，其重要农艺性状的功能基因组研究是植物生物学研究的热点。表型数据的获取依靠人工筛选劳动量大、效率低，受人工主观因素影响大。而且随着劳动力成本逐年增高，表型检测的成本逐年升高[3]。此外，某些表型数据的获取只能以破坏水稻植株的完整性为代价，无法获取植株生长发育的动态性变量。

表型组学是指在基因组水平上系统地研究某一生物或细胞在各种不同环境条件下所有表型的学科[4-5]。近十年来，随着植物高通量表型无损获取方法及数据获取设备的发展，表型组学研究手段开始应用于植物基础研究和作物育种中[6-8]。高通量表型分析平台可用于筛选大型植物种群、鉴定种质资源、绘制遗传图谱、提高表型数据获取的精准度且无损伤性，同时通过自动化、远程操控及图像数据分析，实现劳动力低投入[9]。当前，表型组学在水稻研究应用中，对单一或少数表型研究相对较多，从组学角度出发对水稻表型进行的研究较少[4]。

随着测序技术的快速发展，水稻全基因组水平上的功能分析进入高通量时代[10]，如已深入解析了S5、GS5、SNAC1、RID1等调控重要农艺性状的关键基因功能[9,11-14]。但由于表型分析工具的落后，限制了解析数量性状遗传学的能力。显然高通量表型组学成为功能基因组学及作物育种研究的新瓶颈之一[4]。为此，植物表型组学研究，结合高通量表型分析平台和基因组分析技术，必将成为植物基础研究学者快速解码大量未知基因功能的重要科学工具，对发现并揭示作物重要基因功能，加强和提升我国在作物功能基因组及作物遗传改良领域的地位有非常重要的意义。本文从常用公共文献数据库中检索已发表的关于水稻领域表型组学研究的文献，对目前的研究现状进行列举综述，旨在概括目前表型组学在水稻研究中的应用方向，为以后的相关研究提供理论基础。

1 基于植被指数评估水稻产量

水稻育种方案中通常以株高、叶长、叶宽、叶角、穗型、分蘖数等冠层结构参数为主要选择指标。冠层光合作用的改善对提高水稻生物量和产量具有重要意义[15,16]。如何快捷高效地获取冠层结构参数是目前水稻冠层光合作用研究需要解决的问题之一。到目前为止，还没有一种稳健的方法判定冠层辐射利用效率（radiation use efficiency, RUE）的最佳参数组合。3D冠层光合作用模型(threedimensional canopy photosynthesis model, 3dCAP)有效地结合了3D冠层结构、冠层垂直氮分布、光线追踪算法和叶片光合作用[17,18]。Chang等[19]研发了一个高效的 3dCAP参数化工作流程，可以预测不同气候条件下水稻不同氮肥处理的日冠层RUE。并且利用3dCAP，研究了分蘖数、分蘖角和叶角三种冠层结构参数对冠层 RUE的影响。该研究结果表明通过多种参数组合可以得到相似的冠层RUE。该新模型的研发为应用于改进型冠层 RUE的水稻模型设计工作奠定基础。此外，Chang等[19]研究报道了一个整合了冠层三维结构、冠层垂直氮分布、光线追踪算法和 C3叶片光合模型的三维株型与冠层光合模型 3dCAP模型，该模型具有一套参数化算法，从水稻植株、分蘖、穗及籽粒等方面高效采集模型输入参数。同时，他们还设计了用户操作系统，可实现冠层结构模拟、冠层光合模拟、植株株型优化、栽培密度优化等多种研究目的。

时间序列植被指数（time-series vegetation indices, VIs）通常用于粮食产量估算，该指数受到品种背景、光照及大气条件等多种内外因素的影响，这影响了作物产量的评估准确性。利用遥感手段估测水稻产量，极大提高了工作效率，但其精度也受水稻生育期的影响。为此，Wang等[20]利用无人机搭载Rikola高光谱成像仪，获得了分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、灌浆期、成熟期等关键生育期的高光谱图像和水稻产量，提出了基于地块层次的相对植被指数（relative vegetation index）和相对产量，在水稻产量估算中，确定了不同生育阶段的最佳植被指数型及其波段组合。该方法进一步丰富了基于遥感数据的水稻产量估算技术系统。为解决水稻不同生育期需要使用不同估测模型的问题，Jiang等[21]在水稻不同生育期分别获取高光谱分辨率的多光谱影响和高地表分辨率的RGB（red-green-blue）图像。利用运动恢复结构（structure from motion, SfM）算法，从 RGB影像中获取水稻冠层的点云结构，然后构建不规则三角网（triangulated irregular network, TIN），利用TIN提取水稻冠层的几何结构信息，将水稻田的积温（growing degree days,GDD）作为气候信息。之后分别对比光谱、几何结构、光谱+几何结构、光谱+几何结构+气候信息四种方法的估测精度。最后确定光谱+几何结构+气候信息的方法对生物量的估测精度最高。该研究提出了一种将光谱信息和水稻冠层几何结构信息以及种植区域的气候信息结合的生物量估测方法，提高了全生育期生物量估测精度。为了解决水稻生育后期稻穗的出现对遥感预测形成干扰而导致估测精度下降的问题，Duan等[22]提出了一种植被指数和混合像元分析相结合的方法，在水稻的孕穗期和抽穗期，分别获取多光谱无人机影像以及地面实测数据。将得到的植被指数和水稻叶片、穗及种植土壤等丰度信息相结合，在两个时期内分别建立基于无人机影像的植被指数与水稻产量之间的关系，研究表明该分析方法可明显提高水稻抽穗期的估产精度。

2 基于水稻生长动态评估施氮量

水稻植被生长动态变化与施氮量密切相关。有效评估水稻不同生长时期的植被指数，对于种植早期诊断和施肥的定量调控具有重要意义。新兴的高通量植物表型分析技术，使得人们对于水稻植被动态指数的掌握提升到新的层面。Zhu等[23]提出了一种利用水稻植株点云的端到端重建体系，根据水稻植株特性精确地分割不同类型的点云，采取表面和边缘拟合以确保生成精准的平滑度，最后通过后处理得到真实的可视化效果。该研究所获取的水稻点云有助于精准掌握水稻生长动态。为了快速准确判断水稻种植密度与施氮量的相关性，Liu等[24]开发了一种基于数字图像的水稻产量预测与评估的简单模型。研究结果表明施氮量和种植密度对水稻产量有显著影响。水稻产量随着施氮量的增加先增后减，而随种植密度的增加而增加。水稻冠层的归一化红光（normalized redness intensity, NRI）、绿光（normalized greenness intensity, NGI）及蓝光（normalized blueness intensity, NBI）强度值主要受施氮量的影响，而与种植密度不存在显著相关性。有效评估水稻种植指数对种植早期诊断和追肥的定量调控具有重要意义。Zhang等[25]选用三个典型的粳稻品种并施用不同量的氮肥设置不同组别，利用传感器在水稻早期至中期多次收集光谱反射率数据，随后根据数据计算最佳植被指数并建立动态模型和季节性粮食产量预测模型。最终分析表明归一化差异红边指数（normalized difference red edge,NDRE）适用于水稻氮素营养分析，基于NDRE模型的特征平台值准确预测了水稻种植条件与产量水平间的差异。该研究所构建的新动态模型有效地预测了水稻茎秆伸长和孕穗期籽粒产量，为水稻生产氮肥追肥管理提供了实时氮素营养数据。此外，对水稻冠层变量进行无损快速估算是精准施氮的有效措施。高光谱遥感可用于及时准确地分析冠层的理化性质。然而种植背景中的土壤和水等成分差异使得冠层光谱反射（canopy spectral reflectance,CSR）预测作物氮利用变得复杂。Din[26]等建立了动态冠层氮状态指标、叶片干重、叶片氮浓度、叶片氮积累与冠层光谱反射衍生的新高光谱植被指数（hyperspectral vegetation indices）之间的定量关系，并分析了利用这些定量关系在不同水稻生长时期对碳氮变量进行评估的合理性。该研究为水稻生长期氮素施用的精确管理提供了一种快速、准确的冠层氮指数估算方法。

3 基于高通量表型组学和基因组学平台鉴定QTL位点

基于光学成像和图像分析技术，可自动化连续无损持续测量水稻表型，通过结合基因组学，可定位到引起水稻植株表型差异的基因位点。稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）是水稻产区的主要害虫之一，导致严重的水稻产量损失，且由此带来农药污染等一系列环境问题。确定新的稳定抗源对于有效治理稻纵卷叶螟具有重要意义。利用高通量表型和基因组学分析平台进行稻纵卷叶螟抗性的表型×基因型×环境互作分析，发现在不同环境条件下，受损叶面积、损伤程度及叶片长度等均具有非常高的广义遗传力，主要归因于基因型效应，相对来说叶片宽度遗传力则较低，受环境影响较大。最后通过联合分析筛选出适用于培育具有抗稻纵卷叶螟品种的两种稳定基因型[27]。

由于缺乏适当的供体，以及缺乏高通量表型和基因型×环境相互作用的分析平台，限制了水稻籽粒蛋白质含量（GPC）的主效 QTL的鉴定。Chattopadhyay等[28]使用籽粒蛋白供体 ARC10075和高产栽培品种Naveen开发了BC3F4定位群体，并采用40K Affimetrix自定义SNP阵列对190个品系进行基因分析，以鉴定影响蛋白质含量的稳定QTL。在三个已鉴定的QTL中，一个是关于水稻籽粒蛋白质含量（qGPC1.1）的，另两个与在环境中稳定遗传的单粒蛋白质含量(qSGPC2.1,qSGPC7.1)有关。作者在这些已鉴定的 QTL中，假设存在一些控制种子贮藏蛋白的功能基因，并在基于NIR光谱的BC3F5群体中利用qGPC1.1进行高通量表型验证。随着qGPC1.1在第1染色体短臂端粒区的渗入，高蛋白系中谷蛋白含量升高。这一点得到了编码谷蛋白家族蛋白 QTL区域内候选基因的支持。冠层温度可作为气孔导度的良好指标。为了解普通和高产水稻品种间气孔导度表型差异的遗传基础，Fukuda等[29]对冠层温度进行了数量性状基因位点分析，利用可见光图像和热图像采集冠层温差数据，定位到第11染色体短臂上稳定的QTL位点qCTd11。该研究结果表明qCTd11不仅参与调节冠层温度，还影响气孔导度和光合速率。

4 基于表型组学平台分析水稻胁迫响应

水稻种植过程中易受洪涝、干旱、温度、气候、土壤盐渍化等不同胁迫的诸多挑战。利用表型组学手段深度剖析水稻胁迫响应表型差异，为培育优质高产且耐受性强的水稻品种提供技术支撑。

水稻的根系结构指其根系的空间构型，决定了其对营养吸收和水分利用的效率。由于不同品种水稻的根系结构具有丰富的多样性，影响植物的生理功能并且与它们在环境中的适应性息息相关，因此当前研究迫切需要高精度量化根系结构以了解其与根功能之间的关系[30,31]。Han等[32]开发出一种用于水稻RSA 3D定量的成像系统，利用该系统对育成的 20个水稻品种幼苗的二维侧视图像捕获，随后从图像中分离出根，最后构建水稻根系的3D图像，并利用3D图像量化表型性状。该研究结果表明，20个品种的根形态和根的功能之间的确具有高度多样性；随着气候日益恶化，可用淡水资源日益减少和高温频发，这些均严重影响水稻产量。CaineR等[33]研究发现，通过过表达水稻表皮形成因子OsEPF1，高产水稻品种IR64在产生较少气孔的同时仍能保持较高的产量，这种低气孔密度的水稻植株具有耐高温和耐旱性；Dasa等[34]利用可见光、近红外（VNIR）和短波红外（SWIR）光谱对缺水胁迫下，水稻叶片的蔗糖、还原糖和总糖含量变化进行了模拟，通过高光谱数据分析不同胁迫水平下的蔗糖、还原糖和总糖含量，筛选出最佳植被指数和糖分检测的最佳多元模型，快速无创监测水稻蔗糖、还原糖及总糖动态。传统的耐旱性评估通常误差较大且量化不足。为此，Duan等[35]利用表型组学手段在受控田间环境下动态量化作物干旱响应。首先对不同生长点的水稻单株的 RGB图像进行分析，得出干旱响应特征，利用这些特征区分耐旱和干旱敏感材料，并在不同时间控制条件下量化动态干旱反应。该分析平台可提供一个不依赖于人工的量化干旱反应工具，对未来育种和功能基因组学研究具有普遍的意义。有研究表明，在较高的CO2环境生长会导致水稻中的蛋白质、铁和锌含量都显著下降。为了验证该结论的准确性，Zhu等[36]通过表型组学技术手段在不同地区构建特定种植区，模拟未来50年的大气CO2浓度，结果表明蛋白质、锌和铁的水平分别下降 10%、8%、5%，各类维生素含量也有所下降。尽管不同品种对高浓度CO2的响应区别很大，但整体而言，高浓度CO2对水稻品质带来不利影响；Moura等[37]以表型和生理学手段鉴定具有优异耐冷性的水稻种质。用籼稻、粳稻及籼粳稻杂交材料探究水稻品种的遗传多样性和生态多样性。通过生长温度调节进行主成分分析，发现耐寒性较好的一些试验品种。该研究有助于为水稻耐寒性品种的育种工作奠定基础。本实验室目前正利用表型组学技术研究水稻耐盐性鉴定技术指标，探索了耐盐性不同的水稻品种在盐胁迫处理下苗期不同光合荧光参数变化，初步获得了与水稻耐盐性密切相关的荧光参数。在今后工作中，我们将利用该参数加快耐盐水稻种质资源的筛选和耐盐育种单株的选择。

5 其他表型组学应用

叶氮含量（leaf nitrogen content）已被确定为决定光合能力的关键植物性状。准确、快速、无损测量水稻剑叶氮含量对遗传学家和育种工作者具有重要意义。Wang等[38]开发出一款具有三波段差比光谱指数的传感器（R755、R513、R508），能够实现无损实时测量水稻花期的叶氮含量，为表型组学在不同水稻品种的不同生长阶段实现叶氮含量无损测量应用奠定了基础。Qu等[39]研究了水稻叶片光合和生物量累积之间的关系，调查了来自中国和美国的大量水稻品系的4个表型性状和14个光合作用参数，结果发现弱光下的光合作用速率与生物量累积显著相关，且具有很高的遗传效应。不同水稻品种间弱光下的光合作用速率差异显著，该参数的挖掘有利于丰富现代水稻育种流程的测量指标体系。为提高水稻种子耐低氧的萌发能力，有效缓解由于播种后降雨量导致直播稻产量降低的状况，Ghosal等[40]通过构建具有耐低氧萌发潜力的两个遗传图谱，在不同环境条件下对水稻种子萌发情况进行表型分析，利用竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR, KASP)高通量SNP检测技术进行基因分析，最终鉴定了水稻品系QTL的不同组合，后续用于进一步精细定位和调控机理研究。

6 展望

水稻基因组学研究为揭示水稻农艺性状的生长规律提供了重要的理论基础，但其中传统高通量表型数据的获取存在劳动量大，统计效率主观偏差大等问题。高速发展的水稻基因组学研究同刚刚起步的水稻表型组学研究之间的矛盾，已成为制约水稻优质高产育种理论实现的瓶颈之一[41]。针对水稻的全表型数据分析会产生海量数据，目前的数据分析方法很难从这类数据集中提取出有意义的生物学信息。这需要开发更加精确、高效、处理性强的算法获取更加可靠的数据；另一方面，需要表型组学与基因组学、转录组学等多组学相结合，将具体的表型性状与相对应的遗传信息联系起来，量化分析水稻特定表型的遗传规律，从不同角度多方位解析水稻重要发育过程。

从表型组学概念提出至今，外文文献中以作物表型组学为主题的文献有 288篇，中文文献约 20篇[4]，随着高通量作物表型获取手段的不断开发和完善，关于作物表型组学的研究越来越多，其中以水稻表型组学为主题的报道有 37篇，分别是关于逆境胁迫[27, 34, 35, 37, 42-46]、光合作用[33, 36, 39, 47]、农艺性状[19, 20, 24, 29, 48-54]、氮肥管理[25, 26, 38]和种子活力[40]等的研究。

此外，在检索到的288篇有关作物表型组学的研究中，关于表型组数据库的研究仅 20余篇。目前植物表型组学数据库有9个，但是针对水稻表型组学的完善数据库尚未建立[4]。水稻表型组学作为一个快速发展的领域，新的表型获取手段和研究方法不断出现，只会催生越来越庞大复杂的水稻表型组数据。因此，构建特定水稻表型组标准数据库，将成为日后的工作研究重点。