微管异常与肌萎缩侧索硬化症

宋彬彬，陈峥，贾炳泉，李凤囡，朱文艺，杨璇，陈艳清，于佳

微管是由13条原纤维构成的直径约25 nm的空心管状结构，每条原纤维由α-和β-微管蛋白（tubulin）二聚体线性排列而成。微管两端具有极性，正端最末端是β-tubulin，聚合速度快，处于动态的聚合和解聚的转换状态，使微管正端快速伸长或缩短，即微管的动态不稳定性；负端集中于近核区的微管组织中心，最末端是α-tubulin，聚合速度慢，较稳定[1]。微管散布于胞质中，起到细胞骨架的支撑和轴突运输的轨道作用。神经元具有轴突和树突分支，其中运动神经元体积较大，轴突较长，对微管依赖的蛋白质、亚细胞器和营养因子等长距离运输需求尤甚。肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是最常见的运动神经元病，微管结构和功能的异常变化与疾病发生发展紧密相关[2]。本文就微管组成和调控相关蛋白的结构和功能、ALS中微管异常的原因及微管异常引起运动神经元变性死亡的可能机制进行综述。

1 微管组成和调控蛋白的结构和功能

1.1 微管正端示踪蛋白（plus-end tracking proteins，+TIPs）

末端结合蛋白（end-binding proteins，EBs）是位于微管正端重要的结合蛋白，哺乳动物细胞中主要有EB1、EB2和EB3亚型。EBs蛋白N端的CH（calponin homology）结构域具有微管亲和能力，介导其与微管的结合；C端的卷曲螺旋区域负责EBs单体的二聚化，也可与其他具有CAP-Gly和SxIP（serine/threonine any amino acid isoleucine/leucine proline）修饰的+TIPs相互作用；保守的EB同源结构域（end binding homology domain，EBH）与卷曲螺旋结构域部分重叠；C端最末区域为高度保守的EEY/F基序。EBs主要作为微管正端的支架蛋白位于+TIPs的中心，为蛋白质的结合提供平台，有效形成和维持微管正端的完整性和功能[1,3]。根据+TIPs与EBs的结合，可将+TIPs分为3类：CAP-Gly蛋白、SxIP蛋白及EBs非依赖型蛋白。

CAP-Gly蛋白主要包括细胞质连接蛋白（cytoplasmic linker protein，CLIPs）和 p150glued：①CLIP170是神经元中主要的+TIPs，其N端具有CAP-Gly结构域，可与EB1和α-tubulin的C端EEY/F基序结合；C端具有锌结合域和EEY/F基序，可与具有CAP-Gly结构域的+TIPs相结合[4]；②p150glued是由DCTN1基因编码的，动力蛋白激活蛋白dynactin最大亚基。p150glued的N端具有CAP-Gly结构域，可与含有EEY/F基序的α-tubulin以及EB1和CLIP170直接结合；CC1结构域可与动力蛋白dynein的中链结合。EB1、CLIP170与p150glued相互作用可以抑制微管正端崩解[5]。

SxIP蛋白是+TIPs最多的类型。CLASP1/2、APC2、MACF1/2等具有SxIP修饰的蛋白与EBs结合定位在微管正端，可以捕获动态的微管末端，调控微管运动或静止，从而调节神经元分化、发育和轴突运输功能[1]。

+TIPs中也有dynein、kinesin、XMAP215/DIS1和LIS1等EBs非依赖型蛋白：①动力蛋白dynein的重链和部分驱动蛋白kinesin的重链具有微管结合区域，与微管直接结合，调节微管结构和货物沿微管的运输[6]；②XMAP215/DIS1家族蛋白为微管聚合酶，通过其N端的TOG结构域定位于微管正端，可招募tubulin二聚体到微管的生长端，提高微管组装和聚合速度；③LIS1蛋白N端具有LIS同源蛋白结构域，C端具有WD40重复序列，通过WD40主要与dynein相互作用定位在微管正端，活化dynein[4]。

1.2 微管负端示踪蛋白

大部分γ-tubulin可在微管负端形成γ-tubulin环状复合体，具有微管成核活性，调控微管的组装[7]。哺乳动物中发现CAMSAPs（calmodulin-regulated spectrin-associated proteins）家族蛋白 CAMSAP1、CAMSAP2和CAMSAP3是独立于γ-tubulin的微管负端蛋白。不同亚型的CAMSAPs可特异性抑制微管负端的聚合或崩解，调节微管负端生长速度[8]。

1.3 微管结合蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）

MAPs是附着在微管多聚体上，参与微管组装，决定微管网络三维结构，并可作为微管与其他蛋白质相连的桥梁。MAPs主要分为3类：①MAP1A/MAP1B。MAP1与微管结合能力较弱，其C端与tubulin结合，N端可与其他细胞骨架或质膜连接，调控微管的空间分布。②tau、MAP2和MAP4。tau和MAP2主要定位于微管不稳定区域（易被秋水仙素解聚的区域）的微管晶格内，增强微管蛋白间连接，抑制微管解聚，促进微管成束[9]。MAP4可正调节微管的动态不稳定性[10]；③其他类型如MAP6。MAP6与微管结合可以抵抗低温引起的微管解聚[11]。

1.4 微管切割蛋白

细胞中最常见的微管切割蛋白是katanin和spastin，二者为微管剪切ATP酶，可结合在微管稳定区，在微管表面形成六聚体，从微管晶格中快速提取tubulin，使微管断裂，调节微管长度和数量。大鼠海马神经元中katanin或spastin表达水平提高可增加较短微管数量，微管正端组装活跃，轴突分支增多[12]。

1.5 tubulin翻译后修饰

最初发现tubulin乙酰化发生于α-tubulin的第40位赖氨酸，即K40位点。tubulin乙酰化水平由乙酰转移酶和去乙酰化酶HDAC6（histone deacetylase 6）和SIR2（sirtuin2）活性调节。Kiesin-1或dynein主要与乙酰化的α-tubulin结合，促进双向运输[13]。PC-12细胞中微管稳定性与乙酰化微管蛋白水平呈正相关[14]。

大部分细胞中α-tubulin发生酪氨酸化/去酪氨酸化循环。微管蛋白羧肽酶可以特异性去除α-tubulin C端尾部EEY/F基序中酪氨酸（Tyr），暴露出相邻氨基酸残基谷氨酸（Glu）残基，形成Glu-MT，即去酪氨酸化。TTL（tubulin-tyrosine ligase）可以催化其逆反应，减少Glu-MT的形成[15]。CLIP170与Glu-MT结合能力较弱，酪氨酸化α-tubulin富集于微管不稳定区，可招募p150Glued和CLIP170等具有CAP-Gly结构域的蛋白质与微管正端结合[16]。

tubulin具有磷酸化位点。周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases，CDK1）可使β-tubulin的S172位点磷酸化，在细胞分裂过程中调节微管动力学。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）可使α-tubulin羧基端磷酸化，具体位点仍未明确。磷酸化的tubulin与MAPs结合能力改变[17]。

多聚甘氨酰化和多聚谷氨酰化发生于tubulin羧基端。多聚甘氨酰化是在tubulin羧基端谷氨酸位点在甘氨酸连接酶的作用下与长链甘氨酸修饰相连。而多聚谷氨酰化是在tubulin羧基端谷氨酸位点在tubulin酪氨酸连接酶的作用下与长链谷氨酸修饰相连，发生于神经元的大部分微管。多聚谷氨酰胺化tubulin更易与MAPs相结合[18]。

2 ALS中的微管异常

ALS是主要累及大脑、皮质和脊髓运动神经元的神经退行性疾病，分为家族性ALS（familial ALS，fALS）和散发性ALS（sporadic ALS，sALS）。其受损运动神经元中发生微管组成和调控相关蛋白表达水平改变、轴突形态或运输障碍，提示微管结构和功能异常。

2.1 超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）

fALS患者中约20%为SOD1突变。SOD1G93AALS小鼠模型中运动神经元中微管动态不稳定性增强，tau和MAP2积累[19]；SOD1G93A小鼠出生后120 d脊髓中去HDAC6蛋白及其mRNA水平显著下降[20]。SOD1G93AALS小鼠出生早期（50～70 d），运动神经元轴突完整性出现损伤，而提高乙酰化tubulin水平可以在ALS早期维持运动神经元轴突的完整性，减少轴突变性[21]，增加NMJ对腓肠肌的神经支配功能，神经元数目有所提高，延长ALS小鼠生存期[22]。Tateno等[23]研究发现SOD1G93A小鼠模型脊髓运动神经元和过表达SOD1G85R NG108-15细胞中，SOD1错误积聚招募货物接头蛋白kinesin亚基KAP3，使KAP3功能受损，引起货物蛋白ChAT运输障碍；过表达SOD1G85R的NG108-15细胞中，加入秋水仙素处理可加剧ChAT运输障碍。SOD1G37RALS小鼠模型脊髓组织中，CDK5活性增强，使tau高度磷酸化[24]。且乙酰化tubulin水平增龄性改变：4月龄SOD1G37R小鼠模型的脊髓中SIRT1（SIR2同源蛋白）水平轻微增加；10-12月龄ALS小鼠脊髓中SIRT1水平显著上调[25]。果蝇中过表达SOD1A4V和tau可使磷酸化tau水平显著增加，毒性增强。COS-7细胞中过表达SOD1A4V可提高不溶性tubulin水平。体外研究发现突变的SOD1可抑制tubulin的聚合[26]。

2.2 TAR DNA结合蛋白 43（transactivating response DNA binding protein 43，TDP-43）和肉瘤融合蛋白（fused in sarcoma，FUS）

TDP-43和FUS是fALS致病基因，可参与调控RNA剪切、稳定性、运输和表达等。ALS中突变型TDP-43和FUS核输入信号受损，可错位形成胞质不溶性包涵体[27]。TDP-43突变或表达下降会损伤其调控RNA结合和剪切功能，可能改变MAPs表达水平，从而影响微管结构和功能[2]。果蝇神经元中敲减TDP-43会上调Map205（哺乳动物MAP4同源蛋白）水平[28]；减弱线粒体双向轴突运输[29]。HEK293细胞中敲减TDP-43使HDAC6 mRNA和蛋白水平下降[30]。果蝇运动神经元中过表达TDP-43WT和TDP-43G298S可以改变Futsch mRNA的运输和翻译，NMJ中Futsch蛋白水平显著下降；NMJ突触终扣数量明显减少，突触终扣中Futsch阳性的环状微管减少，乙酰化tubulin水平显著下降；过表达Futsch增加微管稳定性可提高终扣数量[31]。NIH/3T3细胞中过表达TDP-43A315T可减少去酪氨酸化tubulin水平[15]。

NIH/3T3细胞中过表达ALS致病型FUS突变产生的FUS包涵体也可使去酪氨酸化tubulin水平下降。过表达kinesin-1或抑制FUS包涵体的产生会缓解FUS突变引起的去酪氨酸化tubulin水平的下降[15]。Guo等[32]研究发现，FUSR521H和FUSP525L患者多能干细胞衍生的运动神经元中线粒体、内质网囊泡轴突运输受损，运动的线粒体和内质网囊泡数量进行性下降；线粒体结合内质网膜（mitochondria-associated ER membranes，MAMs）结构域受损，提示细胞骨架发生变化。抑制HDAC6的表达提高乙酰化tubulin水平会缓解FUS突变引起的轴突运输障碍。

2.3 动力蛋白激活蛋白1（dynactin1，DCTN1）

ALS中p150glued CAP-Gly结构域突变或缺失使p150glued与微管蛋白结合能力显著下降；与EB1、CLIP170相互作用减弱。而且p150glued G59S突变会阻碍CAP-Gly结构域的折叠，使p150glued在胞质异常积聚，微管重新聚合能力下降[33]。本课题组最新研究发现，9月龄运动神经元中p150glued缺失小鼠模型的脊髓组织中乙酰化α-tubulin水平显著增加，18月龄时小鼠腓肠肌神经肌肉接头碎裂，去神经支配[34]。Hela细胞中敲减p150glued后溶酶体定位分散，自噬体与溶酶体共定位减少，提示p150glued水平下降可能引起溶酶体或自噬体运输障碍，使二者融合受阻[35]。p150gluedG59S小鼠模型的脊髓运动神经元胞体和轴突肿胀，部分有髓鞘的轴突发生沃勒变性[36]。果蝇神经元中过表达p150gluedG59S可使轴突远端突触终扣数量和体积增加，致密核心囊泡（dense core vesicle，DCV）和内体积累[37]。

2.4 囊泡相关膜蛋白相关蛋白B（vesicle associated membrane protein associated protein B，VAPB）

VAPB突变可以引起fALS，也称ALS8。小鼠海马神经元中发现VAPB与微管存在相互作用，其可在单根微管上出现聚集[38]。果蝇神经元中过表达DVAPV260I（人中ALS致病突变VAPBV234I）可使神经肌肉接头突触终扣数量增加，体积减小，形态改变，且突触终扣中Futsh（MAP1B同源蛋白）阳性的环状微管比例增加[39]。HEK293细胞中过表达VAPBP56S可使tubulin与线粒体外膜蛋白Miro-1的结合减少，破坏线粒体正向运输[40]。

2.5 肌萎缩侧索硬化蛋白2（ALS2）

ALS2基因突变或功能缺失与青少年型ALS发生有关。Gros-Louis等[41]研究发现ALS2缺失小鼠模型130 d时，坐骨神经中tubulin水平增龄性显著增加，且tubulin相关的轴突运输受阻。Devon等[42]发现ALS2缺失小鼠12月龄时，皮质运动神经元胞体和轴突直径变小，内体融合和神经营养因子受体TrKB运输受损，提示微管的细胞骨架功能和运输功能发生异常。

2.6 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF为神经营养因子，可以促进神经元存活和突起延伸，而ALS患者和SOD1G93A小鼠模型中VEGF蛋白和mRNA水平下降[43]。VEGF delta/delta小鼠模型神经元中VEGF表达水平下降，5月龄时出现运动功能障碍等ALS症状，且脊髓运动神经元中tubulin、tau、MAP1b和MAP6等基因水平下降[44]。ALS小鼠运动神经元中过表达VEGF可通过激活PI3K/Akt通路减轻SOD1G93A的神经毒性[45]，提示VEGF突变可能通过PI3K/Akt通路调节tubulin或MAPs表达，但其具体机制有待深入研究。

2.7 微管蛋白4α（TUBA4A）

TUBA4A（α-tubulin亚型）广泛表达于所有细胞类型，且在神经系统中表达最高，TUBA4A可与β-tubulin、kinesin和MAPs相互作用，调节微管结构和功能。fALS患者中存在TUBA4A突变，造成运动神经元损伤[46]。COS7细胞中过表达TUBA4AR320C会减弱微管重组能力。原代运动神经元中过表达突变型TUBA4A引起乙酰化α-tubulin水平显著下降；TUBA4A突变型与β-tubulin共定位减弱，提示TUBA4A突变型可能由于功能缺失引起微管异常[47]。

2.8 spastin突变

Tremolizzo等[48]研究发现了ALS新型致病突变：50岁意大利女患者出现进行性肢体力量缺陷，重复跌倒的ALS临床症状，脊髓运动神经元数量减少。基因检测发现该患者存在微管切割蛋白spastin c.194G＞A突变，可能破坏spastin功能而引起微管异常。

2.9 sALS

sALS患者皮质神经元中发现高度磷酸化和不溶性tau蛋白沉积，且活化的糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3，GSK3β）与tau共定位，提示tau蛋白的磷酸化可能是由GSK3β活性增强引起[49]；脊髓运动神经元中发现α-tubulin基因水平下降[50]。

3 微管异常参与运动神经元变性死亡的可能机制

微管是神经元调节细胞形态和轴突运输主要结构，运动神经元对微管损伤更为敏感[51]。研究发现，轴突运输受损是ALS的早期症状[23]，可能参与运动神经元变性死亡。

3.1 线粒体运输障碍

线粒体可经双向轴突运输分布于神经元胞体和突起，是细胞产生能量的主要场所，而轴突远端的生长锥和突触区域对能量需求更明显。ALS中线粒体运输异常导致其错误定位可引起神经元局部能量缺陷或钙离子水平异常，产生损伤[52]。

3.2 蛋白质降解障碍

自噬是细胞降解错误积聚蛋白质的主要途径。ALS中微管异常会减弱自噬体的逆向轴突运输，阻碍错误折叠蛋白质的降解，产生毒性引起细胞变性死亡。研究发现，原代大鼠皮质神经元中诱导自噬会明显抑制TDP-43突变积聚体引起的细胞死亡[53]。线虫运动神经元中使用HDAC抑制剂TSA可以提高微管稳定性，恢复轴突运输受损引起的自噬障碍[54]。

3.3 神经营养因子运输障碍

神经营养因子通常是由神经所支配的组织或胶质细胞产生的，进入神经末梢后与其受体（TrkA、TrkB、TrkC和p75NTR）结合，被信号内体包裹后经逆向轴突运输到胞体和轴突，促进胞体合成蛋白质，调控神经元生长、增殖和存活等。ALS中微管异常可能通过影响神经营养因子的定位及其与受体的结合，调节下游信号分子如pERK1/2、B-Raf和p-p38的表达，进而引起运动神经元变性死亡[55]。

4 结论和展望

微管是重要的细胞骨架，参与调控神经元的形态、结构和轴突运输等过程。微管结构和功能的维护需要微管末端蛋白、MAPs、微管剪切蛋白以及翻译后修饰的tubulin等相互协调，可形成复杂的相互作用网络。而ALS早期出现微管异常可能通过神经营养因子运输障碍、自噬障碍、线粒体功能障碍等引起运动神经元变性死亡。目前研究发现微管调节药物对治疗ALS有潜在作用，这为ALS临床治疗提供新思路和参考，有待深入研究开发。