虫草素的分离纯化研究进展

周啟林 孙永健

（1天津天狮学院医学院，天津301700；2天津天狮学院食品工程学院，天津301700）

虫草素学名为3'-脱氧腺苷，分子式为C10H13N5O3，可以溶于水、乙醇、甲醇，但不溶于苯、乙醚等溶剂，属于嘌呤类生物碱。1951年，CUNNINGHAM等[1]从蛹虫草的培养滤液中，用离子交换树脂柱和活性炭柱层析法首次分离虫草素。虫草素具有抑菌[2]、抗病毒[3-4]、调节机体免疫力[5]、抗恶性肿瘤[6]与治疗白血病[7]等多种功效。虫草素的研究已成为生物医药及保健食品等领域中一个热点，尤其在临床抗肿瘤方面更为突出。YOSHIKAWA 等[8]深入研究了虫草素对接种B16-BL6 黑色素瘤细胞小鼠的影响，结果表明，将15 mg/kg的虫草素通过灌胃给药，可以有效抑制瘤块的生长，抑制率高达36%，而且并未在体内引发毒性反应，说明虫草素作为肿瘤药物制剂很安全。丁蔚等[9]对40 只小鼠做了对照试验，结果表明，虫草素可能通过PI3K/AKT/mTOR 通路有效抑制炎症反应，对亚硝基二乙基胺诱导的小鼠出现的原发性肝癌现象表现出了明显的防护作用。LEE 等[10]进行了虫草素对促进人类结肠癌细胞凋亡的研究，结果显示，在虫草素治疗后的18 h，p53、Bax、DR3、caspase-8、caspase - 1、裂 解 的caspase-3、裂解的PARP 表达增加，表明虫草素可以诱导人类结肠癌细胞HT-29凋亡。

目前，虫草素主要通过以下几个方面获取：一是从蛹虫草或九州虫草等天然虫草的菌虫复合体中直接提取[11]；二是从固体或液体发酵培养物中提取[12]；三是人工化学合成，但化学合成工艺复杂，且投入的设备和化学试剂等成本相对昂贵[13]，产率也比较低[14]，所以很难实现大规模生产。虫草素的广泛应用及在现代医药学上的卓著功效，使之价格越来越高。当前，市场价格已达上千元每克（纯度98%以上）。正因虫草素的贵而稀，其提取和分离纯化的研究成为当今的热点。

1 虫草素的提取方法

目前，虫草素较好的提取方法有微波辅助法、超声辅助法、超临界萃取法和加速溶剂萃取法等。

1.1 微波辅助浸提法

曹庆穗等[15]试验得到最佳工艺条件为微波功率405～741 W，时间为4 min，液（mL）料（g）比为39.924，提取1 次，虫草素提取率可达1.17%。与热水提取法相比，微波法提取的虫草素得率高，提取速度快。黄子琪等[16]得到微波法提取最佳条件为功率500 W，pH7，溶剂的比例（水∶乙醇）为1∶3，时间为3 min，虫草素得率可达1.735 mg/g。同时发现，采用微波法提取，提取时间不宜太长，微波功率不宜太高。

1.2 超声辅助浸提法

该方法无须加热，不影响虫草素的生物活性，同时组织破碎的效率高；但不足之处是，提取虫草素的速度比微波法慢得多。房天琪[17]以虫草素平均得率作为指标，比较了超声提取法、热回流法提取虫草素效果，结果超声提取法比热回流法提取虫草素效果更好，虫草素平均得率达1.209 g/100 mL。李喆[18]使用KQ-500DE 超声清洗器的正交试验结果，最佳提取条件是温度60°C，料液比为1∶300，含水量为20%，提取50 min，此条件下虫草素得率为84.2%。

1.3 超临界萃取法

近年来超临界流体萃取技术（SFE）发展迅速。相比传统工艺，超临界萃取法具有无毒、萃取温度低和分离效率高等优点，被人们称为“绿色分离”，适于提取生物资源中的有效成分。陈顺志等[19]以人工培养的虫草发酵物为原料，用超临界流体萃取法提取虫草素，并对虫草素的光谱特征做了分析验证，结果发现，萃取得到的结晶物纯度在98%以上。但该方法提取虫草素的成本较高，不适合规模化提取虫草素。

1.4 加速溶剂萃取法

陈方圆等[20]使用加速溶剂萃取仪（ASE）提取蛹虫草中虫草素，对温度、静态萃取时间、乙醇浓度和循环次数4 个因素进行3 水平的正交试验优化，结果表明加速萃取法提取虫草素的最适条件为温度70 ℃，时间 5 min，乙醇浓度 20%，循环次数 2 次。ASE技术一般在20 min内自动从样品中完成提取目标分析物，可取代超声萃取、微波萃取、索氏提取、煮沸法等多种传统方法。

2 分离纯化方法

国内外对于虫草素的分离纯化方法已有不少研究。目前比较高效高收率的方法有大孔树脂吸附、离子树脂吸附、新兴的高速逆流色谱法以及联合纯化等。

2.1 离子交换树脂法

陈星[21]在pH11 的条件下，使用717 离子交换吸附树脂，用蒸馏水洗脱，在4 ℃静置一段时间后，过滤得虫草素晶体，然后反复使用溶液过饱和的方法制备高纯度晶体。毛宁等[22]使用了717 阴离子树脂纯化虫草素，也成功得到了较高纯度的虫草素晶体。韦会平等[23]采用732 阳离子树脂纯化法，从废弃蛹虫草大米培养基中提取虫草素，纯度可达98.0%以上，且产率达66.0%以上。离子交换法的吸附能力较好，并且装置简单，但用于纯化虫草素时，该方法的解吸率低于大孔吸附法[24]，因此近几年的应用研究逐渐减少。

2.2 大孔吸附树脂法

大孔树脂的孔径与比表面积都较大，内部有三维立体孔结构，具有吸附容量大、再生处理方便等诸多优点；但是有机残留物高，预处理的难度高。关海晴等[25]在30 g/L 的葡萄糖发酵体系中，使用大孔树脂吸附耦合的方法将产量提高到了32.07%，在补料的发酵体系中，该方法将产量提高到了35.78%。李从镇等[26]通过试验发现，最佳解析条件为pH9～12，50%乙醇为洗脱剂，流速3 BV/h，同样使用NKA-II 大孔树脂，结果解析率可以达95%以上。谭琪明[27]以AB-8大孔树脂为吸附树脂，先用纯水洗杂，然后用2倍柱体积的30%酒精洗脱，可完全富集小麦培养基中的虫草素。张虎成等[28]利用大孔吸附树脂AB-8 及十八烷基键合硅胶反相层析柱分离蛹虫草发酵液中虫草素，经大孔树脂吸附后解吸、硅胶分离后洗脱、结晶和重结晶三步，得到的虫草素纯度分别达到40%、90%、99%。周靖等[29]采用大孔吸附树脂联用KB-2 微球柱层析法对虫草素分离纯化的工艺进行优化，结果表明，经大孔吸附树脂XDA-8D吸附后，再用体积分数30%的乙醇解吸附，虫草素纯度从0.4%提高至10.53%，联用KB-2 微球柱层析法分离虫草素，可将纯度提高至66.94%。

2.3 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（HSCCC）的优点主要在于其分离速度快，一般在十几分钟到几十分钟即可完成，并且分离量大，可以轻松实现数十克级的制备分离，但是要达到千克数量级，仪器放大的一些技术问题有待研究解决。目前，已有诸多科技人员在研究用HSCCC 方法分离纯化虫草素，相信在不久的将来，该方法将发展成为一种可产业化的高效分离技术。胡瑕等[30]对高速逆流色谱法的溶剂进行了筛选，用高速逆流色谱法在400 mg 蛹虫草发酵液粗提物中，分离获得了43.8 mg（质量分数为98.7%）的虫草素，实现高纯度制备虫草素目标。陈丽冰[31]采用陶瓷膜对蛹虫草培养基的超高压提取液过滤除杂后，用高速逆流色谱法对虫草素粗提物进行分离纯化，分离时间少于3 h，分离效果良好，虫草素纯度达到97.6%。张忠等[32]采取高速逆流色谱法结合NKA-Ⅱ型大孔树脂吸附，在200 mg 蛹虫草子实体中分离得到10.8 mg 虫草素，纯度高于98%，同样实现高纯度制备虫草素的目标。

应用单一的固定相分离纯化虫草素难度较高，且比较繁琐。所以，为了进一步加强分离纯化的质量、效率以及高回收率，上述方法可组合应用。

3 虫草素的测定方法

近年来，定量测定虫草素的方法有高效液相色谱法、超高效液相色谱法、色谱-质谱联用法、近红外光谱-线性回归分析结合法等。

3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）的分离效率高，选择性好，且检测灵敏度高，可以高效地检测虫草素的含量及回收率。李兵等[33]采用HPLC 法，配合SGE protecol C18 色谱柱，做了虫草素加样回收率试验，测定出加样的平均回收率为100.2%，RSD为1.61%。牛世莉等[34]采用高效液相色谱法，配合使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱，对退化蛹虫草菌株中虫草素含量进行了测定，结果表明退化的蛹虫草菌株，产生虫草素的能力均会下降。蒋发飞[35]采用HPLC 法测定一种冬虫夏草（来自云南省巧家县），结果表明每克样品冬虫夏草中虫草素的含量为6.9 μg，RSD为0.804%。

3.2 超高效液相色谱法及色谱-质谱联用法

雷萍等[36]采用超高效液相色谱法（UPLC）对固体及液体两相虫草产品中的虫草素进行了连续回收试验，5 次测得的固液两相回收率为97%～102%，RSD 为1.7%～3.3%。逄世峰等[37]采用UPLC 法进行了6 组连续虫草素测定试验，并配合使用ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，得到了加样的平均回收率为95.79%，RSD为4.43%。

当前对于UPLC 法测定虫草素的研究尚少，该方法与传统方法相比，具有简便、高效等优点，且无须在液相中加入缓冲盐，未来前景非常广阔。

张铭雅等[38]采用色谱法-串联质谱（HILICMS/MS）的方法，测定蛹虫草中虫草素，线性范围为0.02～5 μg/mL（R2=0.9953），结果精密度小于10.0%，准确度在8.0%左右，具有较好的特异性、灵敏度、重现性，可以用于虫草素等相关成分的微量检测。

3.3 近红外光谱-线性回归分析结合法

王世成等[39]采用近红外光谱和偏最小二乘法相结合，建立了蛹虫草中虫草素的定量分析校正模型，虫草素含量的预测结果与HPLC 检测结果的相关系数为0.9919，校正模型的定标均方差为102 mg/kg，预测均方差为281 mg/kg，该方法可用于蛹虫草中虫草素的快速无损检测。郭伟良[40]在4 个搅拌式发酵罐39次蛹虫草发酵试验中，采用蒙特卡罗偏最小二乘法（MCPLS）识别异常样本，并且采用偏最小二乘法（PLS）建立蛹虫草中各成分的相关模型，用于测定菌丝体各成分的含量，结果表明菌丝体虫草素含量的PLS 模型校正相关系数Rc值为0.7786，相对于具有庞杂成分及固液气三相不断变化的这两个复杂因素来说，可以取得较好回归结果。该方法可以为实现近红外光谱（NIR）技术在线监测真菌发酵关键参数做出重要贡献。

4 小结

大量研究表明，虫草素在生物医药及保健食品等领域有着很广阔的应用前景。但存在问题是虫草素的产量较低，高纯度的产品不易获得，价格较为昂贵。尽管在虫草素的提取、分离纯化和检测等方面已经有了较多的成果，但每种方法各有利弊。如何高效、高产分离纯化虫草素，科学家们还要做更多努力。笔者认为，多种方法组合来制备高纯度的虫草素是必然选择。