不同产地罗汉松叶总黄酮提取工艺的优化与含量测定

摘要：采用回流提取法提取罗汉松[ Podocarpus macrophyllus（ Thunb.）D.Don]叶总黄酮，通过单因素试验，考察提取方法、提取溶剂体积分数、提取体积、提取时间对药材总黄酮含量的影响，采用正交试验优化提取工艺条件，筛选出罗汉松叶总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，罗汉松叶总黄酮的最佳提取工艺为75%乙醇、料液比1：30（g： mL）、回流提取时间0.5 h。该方法重复性较好、稳定、可行。

关键词：罗汉松[ PodocarpMs macrophyllus（ Thunb.）D.Don];叶;总黄酮;提取工艺;紫外可见一分光光度法

中图分类号：R282

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020） 20-0141-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.032

罗汉松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.）D.Don]又名土杉，是罗汉松科罗汉松属植物，主要分布在中国的广西、贵州、江苏、广东、湖南等地[1，2]。据《中药志》记载，罗汉松性平、味淡，含有黄酮类、挥发油、萜类化合物等成分，临床上具有补中益气、祛风除湿、凉血止血等功效，用于治疗关节肿痛、心胃气痛、咳血吐血等疾病[3]。现代科学研究表明[4-9]，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗病原微生物活性、改善心肌供血等作用[10]，还具有抗肿瘤、抗心血管疾病、糖尿病、抗感染和抗病毒等药理作用[11-17]。此外，罗汉松内生的真菌对寄主植物的病虫害具有一定的防御作用[18- 19]。目前，国内对罗汉松叶中总黄酮含量测定的相关研究较少，为保证其药材质量及临床疗效，本研究对12批不同产地的罗汉松叶进行总黄酮含量的测定，采用单因素试验考察了提取方法、提取溶剂体积分数、提取体积、提取时间对提取罗汉松药材叶总黄酮含量的影响，再采用正交试验进一步优选最佳提取工艺，为研究罗汉松药材的质量标准提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试罗汉松药材来源见表1，采集部位均为叶片，经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁教授鉴定为罗汉松，经55℃烘干，备用。芦丁（批号：175125），纯度>98%，购于上海融禾医药科技有限公司;其余试验所用试剂均为分析纯。

1.2仪器

岛津UV1780型紫外一可见分光光度计;法国默克密理博Milli-Q Integral超纯水仪（苏州赛恩斯仪器有限公司）;XS105D型十万分之一天平（梅特勒一托利多称重设备系统有限公司）;KQ5200B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）;DFT-IOOO高速万能打粉机（温岭市林大机械有限公司）。

1.3方法

1.3.1 对照品溶液的制备精密称取105℃干燥恒重的芦丁对照品6.25 mg，加75%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.25mg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备精密称取药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，加75%乙醇30 mL称定重量，回流提取0.5 h，再称定重量，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取过滤液1 mL置25 mL量瓶中，即得样品溶液。

1.3.3 线性方程的制定分别取“1.3.1”的对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加4%的氢氧化钠4 mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min，然后在510nm处测定吸光度[20]。以吸光度对浓度作图，得到线性方程为y= 8.695 2x-0.005 4.R2 =0.999 1，在0.012 5-0.100 0 mg/mL的范围内，浓度与吸光度有良好的线性关系，芦丁线性方程见图1。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验精密称取广西贺州市产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定。于510 nm波长处连续6次测定其吸光度，结果RSD为2.18%，该方法精密度良好。

1.4.2稳定性试验精密称取广西贺州市产的罗汉松药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色，于510 nm波长处分别在0、20、40、60、80、100、120 min测定同一供试液在不同时间下的吸光度，计算药材的RSD为2.92%。结果表明，药材的吸光度在120 min内基本不变，可见药材样品在120 min内稳定。

1.4.3重复性试验精密称取广西贺州市产的罗汉松药材样品6份，每份药材粉末1.0 g，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法于510 nm波长处平行测定其吸光度，计算罗汉松药材叶的平均总黄酮含量为32.40 mg/g，RSD为2.88%，表明该方法重复性良好。

1.4.4加样回收率试验精密称称取罗汉松茎药材粉末6份，每份0.5g，加入芦丁对照品16.2 mg，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法于510 nm波长处平行测定其吸光度，计算总黄酮的含量。由结果可知，平均回收率为99.25%，RSD为2.91%（n=6），表明该方法回收率良好（表2）。

1.5 单因素試验

1.5.1 提取方法的考察精密称取广西贺州市产的罗汉松药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h，30 mL 75%乙醇为提取条件，分别采用超声提取法、回流提取法和浸渍法对药材进行总黄酮的提取，按“1.3.2”的操作步骤制备供试品，按“1.3.3”的方法显色测定其吸光度。

1.5.2提取溶剂体积分数的考察精密称取罗汉松药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，以提取时间1.0 h、30 mL不同体积分数的乙醇溶剂为提取条件，采用回流提取法，以乙醇溶剂不同体积分数对药材总黄酮提取率做单因素试验，设计乙醇体积分数分别为35%、45%、55%、65%、75%和85%，测定其吸光度。

1.5.3 提取时间的考察精密称取罗汉松药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，以30 mL 75%乙醇为提取条件，采用回流提取法，以提取时间对药材总黄酮提取率做单因素试验，设提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，测定其吸光度。

1.5.4提取体积的考察精密称取罗汉松药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，提取时间1.0 h，以75%乙醇为提取条件，采用回流提取法，以75%乙醇不同体积对药材总黄酮提取率做单因素试验，设计75%乙醇提取体积为分别10、20、30、40、50、60 mL，测定其吸光度。

1.6 正交试验

从罗汉松叶中提取药材总黄酮的方法主要为有机溶剂提取法。根据查阅的相关文献[3，20-22]和参考《中国药典》（2015年版），本试验采取不同乙醇为溶剂的提取方法，根据单因素考察结果分析，设置乙醇体积分数、料液比（g：mL，下同）、提取时间这3个条件。根据正交设计助手软件，选用/g（ 34）正交试验设计（表3）。精密称取罗汉松叶药材粉末1.0 g，测定罗汉松叶中总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1提取方法对罗汉松药材叶总黄酮提取率的影响 由图2可知，采用回流提取法，罗汉松药材叶中总黄酮提取率最高，故而选择回流提取法进行后续试验。

2.1.2提取溶剂体积分数对罗汉松药材叶总黄酮提取率的影响 由图3可知，采用回流提取法，以75%乙醇提取罗汉松药材叶中总黄酮，得到的提取率最高。

2.1.3提取时间对罗汉松药材叶总黄酮提取率的影响 由图4可知，分析了不同提取时间对罗汉松药材叶中总黄酮提取率的影响，提取时间为1.0 h时，总黄酮提取率最高。

2.1.4提取体积对罗汉松药材叶总黄酮提取率的影响 由图5可知，当提取体积为30 mL时，罗汉松药材叶中总黄酮的提取率最高。

2.2 正交试验结果

根据正交设计助手软件，试验方差分析结果可知，以罗汉松叶中总黄酮含量为指标，由于各试验因素对罗汉松叶中总黄酮提取效果的影响程度不同。正交试验结果和方差分析（表4、表5）表明，乙醇体积分数和料液比对罗汉松叶中总黄酮的提取工艺有显著影响，而提取时间无显著影响，且各影响因素的强弱为乙醇体积分数（A）>料液比（B）>提取时间（C）。考虑试验效率和时间，故而选择提取时间为0.5 h，因此，本试验最理想的提取方案是A282C，，即乙醇体积分数是75%，料液比是1：30，回流提取时间是0.5 h，此条件下提取效果最佳。

2.3 样品含量测定

精密称取每个产地的罗汉松药材粉末3份，每份约1.0 g，置于锥形瓶中，按照正交试验得到的最佳工艺条件测定各材料的总黄酮含量，药材1-12的总黄酮含量分别为37.09、36.83、38.24、37.31、36.74、32.06、36.18、35.42、36.41、35.35、36.19、35.08mg/g。

3 小结与讨论

以罗汉松叶为研究对象，考察了乙醇体積分数、提取体积和提取时间3个影响因素，采用回流提取法来提取罗汉松叶总黄酮，利用正交试验的方法优选了罗汉松叶总黄酮的最佳提取工艺。根据相关文献，确定影响罗汉松叶总黄酮提取工艺的主要因素是溶剂浓度、提取体积和提取时间等，根据影响因素的选择，采用L0（ 34）正交试验，并进行多次验证试验，结果表明，罗汉松叶的最佳提取工艺为采用回流提取法，乙醇体积分数75%，料液比1：30，提取时间0.5 h，此工艺条件下提取效果最佳，数据可靠。

在相同试验条件下，加入等量相同体积分数的乙醇可能会出现提取效率不一致的状况。具体原因可能是由于罗汉松药材粉末接触乙醇的溶剂面积不一样。但是在加入相同质量的罗汉松叶的情况下，加入乙醇的量越多，对提取的效率有正相关关系。除此之外，还可以考察更多的试验因素，比如提取温度、提取溶剂、溶剂pH和提取次数等，并且每个因素也可以通过单因素考察的方法确定出试验水平，再通过正交设计试验优选出提取率更佳的试验方案。

不同产地罗汉松叶中总黄酮含量差异较大，广西北海市的罗汉松叶总黄酮含量最高，其次是广西靖西市和广西玉林市，而广西贵港市的罗汉松叶总黄酮含量最低。不同产地罗汉松叶总黄酮的含量差异，可能是由于不同地域、不同气候、不同土壤以及不同的采摘季节影响而产生的结果。

罗汉松自然资源丰富，在临床应用中广泛使用。目前，对罗汉松叶总黄酮的研究还较少，为保障其临床合理用药、安全、有效，本研究通过正交试验筛选出罗汉松叶总黄酮的最佳提取工艺，为进一步研究、开发罗汉松的药用资源提供了科学依据。

参考文献：

[1]赵凯丽，黄增琼.罗汉松种子挥发油及石油醚提取物GC-MS分析[J].西北药学杂志，2018，33（2）：153-157.

[2]吴鲁东，梁小洪，李书渊.罗汉松的生药学研究[J].临床医学工程，2012，19（8）：1350-1352

[3]郑玉蓉，吴慧仪，潘素静，等，罗汉松叶中总黄酮的提取与纯化富集工艺研究[J].广东药科大学学报，2017，33（1）：23-27

[4] SATO K，SUCAWARA K. TAKEUCHI H. et alNew cytotoxic nor-and bisnorditerpene dilactones. makilactones A-D. from Podocarpusmacrophyllus D. DonLJ]. Heterocvcles， 2009.78（6）： 1453-1462

[5]张慧，张云，房燕茹，等.植物黄酮类化合物的药理活性研究进展[J].石化技术，2017，24（6）：211.

[6]赵薪苑，陈婧，方建国，等中药和天然药物中黄酮抗病毒活性及其机制研究进展[J].医药导报，2018，37（4）：410-415.

[7] SATO K. SUGAWARA K， TAKEUCHI H， et al. Antibacterial novelphenolic diterpenes from Podocurpus mucrophyllus D.DON[J]Chem Pharm Bull. 2008 .56（ 12）： 1691-697.

[8]张敏中药黄酮成分抗抑郁治疗作用研究进展[J].北华大学学报（自然科学版），2015，16（5）：617-620.

[9] PARK H. KAI N，FUKAYA H.el al.New cVtotoxic nordi-terpenedilactones from leaves of Podocurpus mucrophyllus var.maki[J].Het—erocycles.2004. 63（2）： 347-357.

[10]隗磊，周艷，谢云.不同浓度罗汉松实醇提物调血脂及抗氧化的作用研究[J].湖北中医药大学学报，2015，17（1）：57-59

[11]周燕，隗磊，谭志明，等.罗汉松种子提取物对人胃癌细胞的体外抑制作用[J].中国药业，2014，23（13）：13-15.

[12]马锐，吴胜本.中药黄酮类化合物药理作用及作用机制研究进展[J].中国药物警戒，2013，10（5）：286-290.

[13]祝寅淏，王帅，李瑶，等，黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2018，39（3）：219-223

[14]张丹萍，丁丁.黄酮类化合物药理作用的研究[J].北方药学，2015，12（8）：150-151.

[15]程秋月，郭菁，张成义.黄酮类化合物药理作用的研究[J]北华大学学报（自然科学版），2011，12（2）：180-183.

[16] AJAY M， FRANCIS I A， ALI M M， et al.Quercetin，a flavonoidantioxidant. modulates endothelium-derived nitric oxide bioavail— abiliy in diabetic rat aortas[J] .Nitric Oxide， 2007， 16（4）：442.

[17]陈凯，陈钱，黄成然，等.植物总黄酮抗肿瘤作用机制研究进展[J].吉林医药学院学报，2015，36（4）：293-296.

[18]王国平，王丽薇，一株罗汉松内生真菌及其活性代谢产物[J].中国生物防治学报，2014，30（2）：287-292.

[19]冉雪琴，何映霞，孙端方，等.罗汉松内生真菌的抑菌活性研究[J]。中国畜牧兽医，2014，41（8）：219-223.

[20]魏江存，陈勇，谢臻，等.10批不同产地六棱菊中咖啡酸的工艺优化与含量测定[J].中国药房，2017，28（ 34）：4792-4795.

[21]魏江存，陈勇，谢臻，等，紫外一可见分光光度法测定生大黄和醋大黄的总蒽醌含量[J]井冈山大学学报（自然科学版），2017，38（6）：88-92.

[22]魏江存，陈勇，谢臻，等.紫外一可见分光光度法测大黄不同炮制品总蒽醌含量[J].广州化工，2017，45（ 17）：126-128.

作者简介：刘睿（1983-），女，广西贺州人，主管中药师，主要从事中药学的相关研究，（电话）18177479182（电子信箱）157742387@qq.cm;通信作者，陈朝（1980-），副主任药师，硕士，主要从事医院药学与中药制剂研发，（电子信箱）32605734@qq.com。