猪DKK2基因的多态性与母猪产仔数性状的关联分析

周佳伟 乔木 吴俊静 王孝忠 刘贵生 梅书棋 彭先文

摘要：母猪的繁殖性状是猪重要经济性状之一，但由于其遗传力低，导致母猪繁殖性状常规选择进展缓慢。通过SANGER测序的方法检测DKK2基因内SNP位点，并与产仔数性状进行关联分析。结果表明，在DKK2基因第二内含子存在一个新SNP位点，根据SNP命名方法将其命名为8：g.114967878A>G.且该SNP位点与产活仔数性状显著相关。猪DKK2基因的新SNP位点8：g.114967878A>G对猪的产活仔数性状存在潜在的调控作用。

关键词：猪;DKK2;SNP;产仔数

中图分类号：S828;Q343.1+5

文献标识码：A

文章编号：0439-8114[ 2020） 20-0138-03

DOl：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.031

母猪生产力直接影响猪场经济效益，产仔数性状是衡量母猪生产力的一个主要指标。然而总产仔数和产活仔数的遗传力只有0.09，属于低遗传力性状[1]，导致母猪繁殖性状常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的迅速发展，常规育种与标记辅助选择（MAS）相结合的方法有效地加快了猪产仔数性状的选择进展。通过候选基因法和基因组扫描的方法筛选出多个与产仔数性状相关的分子标记，如雌激素受体（Estrogen receptor，ESR）、卵泡刺激素p亚基（Follicle stimulating hormone p subunit， FSH[3）和视黄醇结合蛋白4（ Retinol binding protein 4，RBP4）基因等[2-4]，但仍然有很多与产仔数相关的SNP位点有待挖掘。

DKK（Dickkopf）蛋白家族是WNT信号通路的负调控因子，主要成员有DKK1、DKK2、DKK3和DKK4。DKK2和DKK4蛋白可结合LRP5/6，抑制WNT信号[5]。研究发现DKK2在上皮性卵巢癌细胞中显著下调，且在上皮性卵巢癌细胞中DKK2具有更高甲基化水平，超表达DKK2显著抑制卵巢癌细胞的生长和迁移[6]。DKK2在出生后2ld内的小鼠卵巢中表达，但在完全生长卵母细胞、排出卵母细胞以及发育早期胚胎中不表达，说明了DKK2是由颗粒细胞合成，且在卵母细胞与颗粒细胞对话中起着重要作用[7]。

研究表明，利用Affyetrix公司猪基因组芯片检测大白猪和二花脸猪排卵前卵泡中差异表达的基因[8]，发现DKK2基因呈现差异表达，通过性状关联分析发现DKK2基因启动子区的c.-1130 T>C与中国瘦肉猪新品系产仔数显著相关;通过双荧光、EM-SA、ChIP验证DKK2 c.-1130 T>C位点影响C/EBP[3与DKK2启动子的结合能力，位点为T时，DKK2基因启动子活性极显著增强，抑制WNT通路基因表达[9]。本研究以DKK2基因为研究对象，探究DKK2基因内与产仔数相关的SNP位点，为母猪产仔数的遗传改良提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 试验样品

采集湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的黑猪新品系417头母猪的耳组织样品，且所有个体均记录了总产仔数和产活仔数。使用标准苯酚氯仿萃取法提取基因组DNA，保存于-20℃。

1.2 PCR扩增

根据猪DKK2基因的基因组序列（GenBank：NC_010450.4）设计引物，引物序列见表1。50 μLPCR反应体系为：100 ng模板DNA、lOxBuffer（含Mg2+）5 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/LdNTPs、1 UTaq DNA聚合酶，ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45 s，35个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR扩增产物用生工生物工程（上海）股份有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化;将回收后的PCR产物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司i井行SANGER测序。

1.3 群体关联分析

采用SAS 9.1软件中一般线性模型将417头黑猪新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位点的基因型与产仔数性状进行关联分析。同时采用REC程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为Yij=+ Gi+Fj+ei，其中，Yij为性状表型值，μ为平均值，G为基因型效应（包括基因加性效应和显性效应;加性效应用1、0和一1分别代表AA、AC和CC基因型，显性效应用1、一1和1分別代表AA、AG和CC基因型）;Fj为猪场综合效应;eij为残差效应。

2 结果与分析

2.1 DKK2基因8：g.114967878A>G位点在黑猪新品系中的等位基因频率

通过SANCER测序检测417头黑猪新品系DNA样品中DKK2基因的SNP位点，在DKK2基因第二内含子区域发现了一个新的A>C突变的SNP位点（图1），将其命名为8：g.114967878A>G，并计算该位点的基因型频率和等位基因频率。结果（表2）表明，在黑猪新品系中DKK2基因8：g.114967878A>C位点表现为AA、AG或GG 3种基因型，A等位基因频率为0.9，是优势等位基因，通过卡方检验发现8：g.114967878A>G位点在黑猪新品系中均符合哈代温伯格平衡（P>0.05）。2.2 DKK2基因8：g.114967878A>G位点与产仔数性状的关联分析

417头黑猪新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位点的基因型与产仔数性状进行关联分析。结果（表3）表明，黑猪新品系中8：g.114967878A>C位点的GG基因型的产活仔数显著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且显性效应达到显著水平（P<0.05），但该SNP位点在黑猪新品系中与总产仔数相关性不显著。

3 讨论

母猪生产力直接影响猪场经济效益，产仔数性状是衡量母猪生产力的一个主要指标。猪DKK2基因是通过基因芯片及EST策略鉴定的新基因，且在大白猪和二花脸猪排卵前卵泡中差异表达[8]。猪DKK2基因定位在8号染色体长臂末端SSC8： 123，274， 617-123， 279， 223（ Ensembl Sscrofa10.2）.通过pig QTL database查询，在DKK2基因附近（SSC8的107.5 cM）存在排卵数性状的QTL，加性效应为3.07[10，11]。因此，DKK2可能为该排卵率QTL的位置候选基因。性状关联分析发现DKK2基因启动子区的c.-1130 T>C与中国瘦肉猪新品系产仔数显著相关;且该SNP位点通过影响DKK2基因的转录，从而调控卵泡发育。

本研究通过SANCER测序方法鉴定出DKK2基因第二内含子内的一个新SNP位点，并将其与产仔数性状关联分析发现该SNP位点的CC基因型的产活仔数显著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且显性效应达到显著水平（P<0.05），为母猪产仔数性状的遗传改良提供了新靶点。

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作者簡介：周佳伟（1989-），男，江西瑞昌人，助理研究员，博士，主要从事猪遗传育种研究，（电话）18674037082（电子信箱）422374839@qq.com;

通信作者，彭先文（1974-），男，研究员，主要从事猪遗传育种研究，（电子信箱）pXWPal@163.com。